二代測序—全外顯子測序的應(yīng)用領(lǐng)域

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：1、疾病診斷：用于診斷各種遺傳性疾病，包括單基因遺傳?。ㄈ缒倚岳w維化、杜氏肌營養(yǎng)不良等）和復(fù)雜疾病（如**、心血管疾病等）。在**研究中，通過對**組織和正常組織進(jìn)行全外顯子測序，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中的體細(xì)胞突變，這些突變可能是導(dǎo)致**發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，有助于醫(yī)生制定個性化的治療方案。2、藥物研發(fā)：幫助研究人員了解藥物靶點的基因變異情況。例如，如果發(fā)現(xiàn)某些患者的藥物靶點基因外顯子區(qū)域存在突變，可能會影響藥物的療效，從而可以針對性地開發(fā)新的藥物或者調(diào)整藥物的使用劑量和方式。

遺傳學(xué)研究：用于研究人類群體的遺傳多樣性，通過對不同人群的外顯子測序，可以發(fā)現(xiàn)不同人群之間的基因差異，這些差異可能與人群的適應(yīng)性、易感性等有關(guān)。還可以用于追蹤基因的進(jìn)化歷程，了解基因在進(jìn)化過程中的變化情況。 什么是二代測序技術(shù)？廣東哪里有二代測序檢測

二代測序——轉(zhuǎn)錄組測序的實驗流程（上）

樣本采集和 RNA 提取

樣本采集需要考慮研究目的和樣本類型。例如，研究**組織的轉(zhuǎn)錄組，就要準(zhǔn)確獲取**組織樣本，同時比較好有對應(yīng)的正常組織作為對照。RNA 提取方法有多種，常用的如 Trizol 法，它可以有效地從細(xì)胞或組織中提取總 RNA，包括 mRNA、rRNA 和 tRNA 等。提取后的 RNA 質(zhì)量至關(guān)重要，需要通過瓊脂糖凝膠電泳或?qū)ｉT的 RNA 質(zhì)量檢測儀器來評估 RNA 的完整性和純度。

RNA 質(zhì)量檢測和定量

完整性方面，通常使用 RNA 完整性指數(shù)（RIN）來衡量。RIN 值越高（一般認(rèn)為 RIN > 7 是高質(zhì)量 RNA），說明 RNA 完整性越好。定量方法主要有紫外分光光度法和熒光定量法。紫外分光光度法可以通過測量 RNA 在 260nm 和 280nm 處的吸光度比值來估計 RNA 純度，比值在 1.8 - 2.0 之間表示純度較好。熒光定量法則是使用專門的熒光染料（如 Qubit）來更準(zhǔn)確地測量 RNA 濃度。

文庫構(gòu)建

首先要進(jìn)行mRNA富集，一般使用帶有poly-T的磁珠來特異性地捕獲mRNA，因為真核生物mRNA的3'端都有poly-A尾巴。然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過超聲或酶切等方法將cDNA片段化，片段大小通常在幾百個堿基對左右。之后在片段兩端連接上測序接頭，經(jīng)過PCR擴(kuò)增來增加文庫的量，使其達(dá)到可以上機(jī)測序的要求。

北京嘉安健達(dá)二代測序公司宏基因組測序也是二代測序。

③二代測序一般多久出結(jié)果？

3、測序深度和覆蓋度要求

測序深度是指每個堿基被測序的平均次數(shù)，覆蓋度是指測序獲得的堿基占整個基因組（或目標(biāo)區(qū)域）的比例。如果要求高測序深度和高覆蓋度，比如進(jìn)行**全基因組的深度測序（測序深度可能達(dá)到100X甚至更高），需要更長的測序時間來獲取足夠的數(shù)據(jù)，并且后續(xù)的數(shù)據(jù)處理和分析也會更復(fù)雜。而對于一些簡單的基因篩查項目，測序深度要求較低（如10X-20X），相應(yīng)的測序和分析時間會縮短。例如，低深度全外顯子測序用于篩查常見突變，測序可能在3-5天完成；而高深度的全外顯子測序用于檢測低頻體細(xì)胞突變，可能需要7-10天甚至更久。

二代測序的建庫步驟③

三、末端修復(fù)和加A尾（以DNA文庫為例）

末端修復(fù)：經(jīng)過片段化后的DNA末端可能是不平齊的，有5'-突出端或3'-突出端。末端修復(fù)反應(yīng)可以利用T4DNA聚合酶、Klenow片段等酶，將這些末端補(bǔ)平，使其成為平末端。T4DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，在合適的反應(yīng)緩沖液和dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）存在下，可以將突出的末端補(bǔ)平。

加A尾：在末端修復(fù)后的平末端DNA分子的3'-末端加上一個A堿基。這一步是為了后續(xù)連接帶有T-突出端的接頭做準(zhǔn)備，一般使用Klenow片段（3'→5'外切酶活性缺失）在dATP存在下進(jìn)行加A反應(yīng)，這樣可以使DNA片段能夠高效地與帶有T-突出端的測序接頭連接。 二代測序讀長方面比一代測序短很多。

二代測序的操作流程有哪些？

1.DNA提取與質(zhì)檢

· 純凈、足量、質(zhì)量好的樣本DNA是檢測成功的基礎(chǔ)（可以來源于血漿、新鮮組織等）

2.DNA處理→文庫構(gòu)建

· 得到統(tǒng)一長度區(qū)間+有接頭的DNA片段

· 步驟：DNA打斷→末端修復(fù)→片段篩選→加A尾→接頭連接→PCR

3.靶向捕獲

· 特定區(qū)域基因的定向檢測

4.上機(jī)測序

· 根據(jù)通量情況選擇測序儀

· 上樣后機(jī)器完成

5.數(shù)據(jù)分析

· 初級分析：光強(qiáng)數(shù)據(jù)（不同熒光標(biāo)記堿基）→序列信息（AGCT）

· 二級分析 多儀器自帶

· 三級分析 vcf文件 可diy 二代測序產(chǎn)出的數(shù)據(jù)量有多少？湖北二代測序原理

二代測序的優(yōu)勢是低成本。廣東哪里有二代測序檢測

二代測序技術(shù)的一些***研究進(jìn)展②

植物基因組學(xué)研究領(lǐng)域 ：

花生四倍體野生種基因組測序：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)殷冬梅教授團(tuán)隊和上海交通大學(xué)韋朝春教授團(tuán)隊聯(lián)合發(fā)布了花生四倍體野生種近乎完整基因組 amon2.0 版本。該研究結(jié)合 ONT 超長讀段、二代測序和 Hi-C 等多種測序技術(shù)，使基因組的連續(xù)性、完整性和準(zhǔn)確性都得到了顯著提高，為花生的遺傳馴化和分子育種提供了重要的基因組數(shù)據(jù)信息資源。

長雄野生稻基因組解析：中科院昆明動物所王文研究組與云南省農(nóng)科院糧食作物研究所胡鳳益研究組等中外機(jī)構(gòu)合作，利用二代測序技術(shù)成功組裝出高質(zhì)量的長雄野生稻基因組，并對其與近緣物種的分歧時間、基因的收縮擴(kuò)張等進(jìn)行了分析，還鑒定出一批可能影響地下莖以及自交不親和性狀的候選基因及代謝途徑，為解析相關(guān)分子機(jī)制提供了重要線索。 廣東哪里有二代測序檢測

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