細胞長滿80%瓶底或皿底，換培養(yǎng)液，第二天提取RNA(倒掉培養(yǎng)液，5-10ml冰PBS洗滌細胞2次空干)加1ml冰TRizoL,用力振蕩培養(yǎng)瓶使細胞完全脫落，加樣器吹打(吸入1.5ml離心管，旋渦振蕩10秒，室溫靜置5分鐘)加氯仿200ul,漩渦混勻器振蕩10秒，冰盒上靜置10分鐘(40C,8000rpm,5分鐘，)吸取上層水相0.5-0.7ml移至另一1.5ml離心管中，加異丙醇0.5-0.7ml(充分混勻，冰盒上靜置10分鐘，40C,12000rpm,15分)棄上清,加75%冰乙醇1ml,顛倒混勻數次(40C,12000rpm,15分)棄上清,沉淀快速風干。但不要完全干燥,加DEPC處理去離子水50-100ul取5ul作RNA電泳，5ul作RNA定量，余-800C冰箱保存實時熒光定量PCR是什么原理？新疆細胞pcr哪家好

PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍山東有哪些pcr原理簡述熒光定量pcr的基本原理。

PCR反應的特異性強，其決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結合；②堿基配對原則；③TaqDNA聚合酶合成反應的忠實性；④靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性明顯增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

PCR實驗技術中的錨定PCR（AnchoredPCR）介紹：錨定PCR主要用于分析具有可變末端的DNA序列，Loh等用A-PCR對人外周血淋巴細胞T細胞受體α-鏈的mRNA的多變性進行了分析。先合成cDNA，并用末端脫氧核苷酸轉移酶在其3’-可變區(qū)末端加上一個PolyG尾巴。Loh等恒定區(qū)與可變區(qū)連接部位設一個引物，另一個引物是一個具5’-polyG尾巴的引物。帶有PolyG尾巴的引物是一個固定點，它可以并與PolyG尾巴結合，無論其余部分序列如何，只識別片段末端，利用此法可從前述mRNA中檢出至少20種不同序列，每一種都是獨特的，表明A-PCR不對任何特殊序列有傾向性結果，可用于T細胞及其它部位抗體基因的研究。pcr檢測做不好都有哪些原因？

PCR的臨床應用主要用于針對疾病遺傳病等。PCR在醫(yī)學檢驗學中**有價值的應用領域就是對疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。一般實驗室也能檢出10~100基因拷貝，而目前病原體抗原檢測方法一般需要105-7個病原體才可檢測到。PCR對病原體的檢測解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。定量PCR研究資料已表明，病原體數量與疾病病情的輕重程度、傳染性及針對效果均有相關性。許多研究表明，人類免疫缺陷病毒(HIV)后，潛伏期長短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量相關；也有研究表明，HIV病毒載量低于一定值時，沒有傳染性。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發(fā)現，病毒的數量與某些藥物的療效相關。例如，干擾素針對對肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有***降低病毒高拷貝的作用。pcr實驗失敗的原因有哪些？陜西常見pcr怎么選擇

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PCR的特異性影響因素有很多，在此我們作一歸納，供大家參考：①退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。③引物二聚體是較常見的副產品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。④改變mgcl2(有時kcl)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應嚴格性或者對taq酶的直接作用。一般認為PCR產物應在48h以內完成電泳檢測，有些比較好于當日電泳檢測，大于48h后帶型就會出現不規(guī)則，甚至消失。新疆細胞pcr哪家好

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