PCR設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC比較好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是較末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列比較好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以比較低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。英瀚斯生物，分子平臺實驗人員十年以上經(jīng)驗，專業(yè)pcr檢測。福建靠譜pcr要多久

長片段PCR通常指擴增大于5kb的DNA的片段。長片段PCR傳統(tǒng)上使用TaqDNA聚合酶（為了快速延伸）和高保真酶（為了準確度）的混合物。隨著高合成能力、高保真DNA聚合酶的發(fā)明，長片段PCR現(xiàn)在可在短時間內(nèi)高準確性的完成。通過與一個強DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合，聚合酶可獲得高擴增能力，可在短時間內(nèi)擴增長片段（如>20kbgDNA的片段）。初次之外，極高保真度（如>100xTaq）可確保長片段擴增的低錯誤率。當擴增>10kb的片段時，PCR實驗方案可能需要在以下5個關(guān)鍵位置進行適當優(yōu)化：確保使用高質(zhì)量、高純度的DNA樣本。如果DNA聚合酶的熱穩(wěn)定較低，使用更多量的DNA聚合酶以彌補多次循環(huán)中的聚合酶活性損失。降低退火和延伸步驟的溫度，以助于引物結(jié)合。適當增加PCR步驟的時間，以促進模板DNA的完全分離及引物的結(jié)合。適當增加PCR延伸時間確保目的片段的全長擴增。浙江有哪些pcrpcr檢測樣本的保存要求與方法？

PCR的臨床應(yīng)用主要用于針對疾病遺傳病等。PCR在醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)中**有價值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。一般實驗室也能檢出10~100基因拷貝，而目前病原體抗原檢測方法一般需要105-7個病原體才可檢測到。PCR對病原體的檢測解決了免疫學(xué)檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。定量PCR研究資料已表明，病原體數(shù)量與疾病病情的輕重程度、傳染性及針對效果均有相關(guān)性。許多研究表明，人類免疫缺陷病毒(HIV)后，潛伏期長短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量相關(guān)；也有研究表明，HIV病毒載量低于一定值時，沒有傳染性。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發(fā)現(xiàn)，病毒的數(shù)量與某些藥物的療效相關(guān)。例如，干擾素針對對肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有***降低病毒高拷貝的作用。

PCR的假陽性主要原因之一引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進器頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。pcr實驗失敗的原因有哪些？

PCR的特異性影響因素有很多，在此我們作一歸納，供大家參考：①退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。③引物二聚體是較常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。④改變mgcl2(有時kcl)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴格性或者對taq酶的直接作用。一般認為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48h以內(nèi)完成電泳檢測，有些比較好于當日電泳檢測，大于48h后帶型就會出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。pcr檢測實驗成功的訣竅！陜西常見pcr怎么選擇

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PCR實驗室設(shè)計的中心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結(jié)果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。PCR擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。 各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行。福建靠譜pcr要多久

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