多色免疫熒光的總體應(yīng)用思路:多標(biāo)技術(shù):實現(xiàn)組織原位上多個靶標(biāo)的標(biāo)記,在染色 panel 中設(shè)置相應(yīng)目標(biāo)細(xì)胞的 marker;實現(xiàn)對多個細(xì)胞類群的識別和染色(各類淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞、細(xì)胞因子等),對靶細(xì)胞的數(shù)量、空間分布、相互間位置關(guān)系等進行定量;實現(xiàn)對樣本Tumor微環(huán)境、Tumor異質(zhì)性、Tumor免疫浸潤水平的描繪,結(jié)果可以應(yīng)用于不同Tumor亞型 / 不同醫(yī)療方案 / 不同實驗因素干預(yù)的預(yù)后判斷 /醫(yī)療效果評價 / 免疫應(yīng)答水平差異解析等場景,并可以聯(lián)合單細(xì)胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)實驗,對其檢測結(jié)果進行組織原位上的驗證和展示。如何有效減少自發(fā)熒光與光譜重疊,以保證多色成像的準(zhǔn)確性和分辨率?上海多色免疫熒光實驗流程
為了追蹤免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物的變化并同時觀察細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件,設(shè)計多色熒光實驗應(yīng)包含以下關(guān)鍵步驟:1.選擇合適的熒光探針:選擇能特異性結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞內(nèi)信號分子的熒光探針,如抗體偶聯(lián)的熒光染料。2.多色標(biāo)記設(shè)計:根據(jù)實驗需要,選擇不同波長的熒光探針,每種探針標(biāo)記不同的細(xì)胞表面標(biāo)志物或細(xì)胞內(nèi)信號分子,確保多色信號互不干擾。3.細(xì)胞處理:將熒光探針與細(xì)胞進行孵育,確保探針與目標(biāo)分子的有效結(jié)合。4.成像系統(tǒng):利用多色熒光成像系統(tǒng),結(jié)合適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)濾光片,分別捕獲不同熒光探針的信號。5.數(shù)據(jù)分析:通過圖像分析軟件,跟蹤細(xì)胞表面標(biāo)志物的動態(tài)變化,并同時分析細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的熒光信號變化。6.時間序列分析:設(shè)計時間序列實驗,連續(xù)觀察并記錄細(xì)胞行為,以揭示動態(tài)過程中的細(xì)胞表面標(biāo)志物變化和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。紹興病理多色免疫熒光TAS技術(shù)原理多色免疫熒光成像:為神經(jīng)科學(xué)提供精細(xì)視覺解析。
在多色免疫熒光實驗中,通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用時,可以遵循以下步驟以避免假陽性信號:1.選擇合適的熒光對:確保供體分子的發(fā)射光譜與受體分子的激發(fā)光譜有足夠的重疊,這是FRET發(fā)生的基礎(chǔ)。2.優(yōu)化實驗條件:調(diào)整供體和受體之間的距離,確保其在FRET發(fā)生的合適范圍內(nèi)(通常小于10nm)。同時,控制實驗條件如溫度、pH值等,以維持蛋白質(zhì)的活性。3.驗證FRET信號:通過比較供體單獨存在和與受體共存時的熒光強度變化,確認(rèn)FRET信號的真實性。同時,利用對照實驗(如加入熒光猝滅劑)來排除假陽性信號。4.結(jié)合多色免疫熒光:在多色免疫熒光實驗中,結(jié)合FRET技術(shù),可以同時檢測多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,提高實驗的準(zhǔn)確性和準(zhǔn)確性。
在進行多色標(biāo)記時,平衡各熒光通道的曝光時間和信號強度是確保整體成像質(zhì)量的關(guān)鍵。以下是一些建議,以適合的成像質(zhì)量同時保持信噪比:1.選擇合適的熒光團:首先,確保選擇的熒光團具有與實驗要求相匹配的激發(fā)和發(fā)射光譜,以減少通道間的串?dāng)_。2.優(yōu)化曝光時間:由于熒光染料的強度較高且不易淬滅,建議設(shè)置較短的曝光時間,通常在3-5ms范圍內(nèi)。過長的曝光時間可能導(dǎo)致背景信號過強,影響成像質(zhì)量。3.調(diào)整抗體濃度和孵育時間:如果縮短曝光時間后陽性信號變?nèi)?,可以考慮增加抗體濃度或延長抗體孵育時間,以增強信號強度。4.控制染料孵育時間:染料孵育時間應(yīng)控制在推薦范圍內(nèi),避免過長導(dǎo)致全片信號過強。5.使用專業(yè)軟件:結(jié)合光譜成像技術(shù)和專業(yè)定量分析軟件,可以精確地調(diào)整每個通道的曝光時間和信號強度,從而確保成像的準(zhǔn)確性和可靠性。6.手動調(diào)整與儀器自動曝光相結(jié)合:在自動曝光的基礎(chǔ)上,根據(jù)成像效果手動調(diào)整曝光時間,以達到合適成像效果。利用光譜拆分技術(shù)和軟件分析,從混淆的熒光信號中解析出每個單獨標(biāo)記。
光漂白效應(yīng)是熒光成像中因光照引起熒光減弱的問題,尤其在長時間或反復(fù)掃描時突出。為確保數(shù)據(jù)質(zhì)量和可比性,采取以下措施:1.光漂白認(rèn)知:明確光漂白現(xiàn)象及其對實驗的影響。2.構(gòu)建漂白曲線:預(yù)實驗中,記錄特定條件下的熒光強度隨照射時間變化,建立漂白參考。3.優(yōu)化成像設(shè)置:依據(jù)漂白曲線,調(diào)節(jié)曝光時間、激光功率等,減少光漂白,可使用中性密度濾光片輔助。4.樣本優(yōu)化:選用耐光漂白染料及保護性封片劑,維持樣本環(huán)境穩(wěn)定,減少外部因素干擾。5.數(shù)據(jù)后處理:運用軟件算法,依據(jù)漂白曲線對熒光強度進行校正,恢復(fù)真實信號強度。6.重復(fù)驗證:跨批次或時間重復(fù)實驗,統(tǒng)一采用光漂白校正流程,確保結(jié)果一致性和可靠性。通過嚴(yán)格對照實驗,驗證多色免疫熒光標(biāo)記系統(tǒng)的特異性和重復(fù)性。徐州病理多色免疫熒光mIHC試劑盒
高靈敏度探測器與高級光學(xué)濾鏡,助力捕捉弱熒光信號,提升圖像質(zhì)量。上海多色免疫熒光實驗流程
多色免疫熒光技術(shù)的關(guān)鍵原理在于其能夠同時檢測和定位細(xì)胞或組織中的多種蛋白質(zhì)或分子。該技術(shù)主要依賴于抗原與抗體的特異性結(jié)合以及熒光標(biāo)記物的應(yīng)用。首先,該技術(shù)將不同的熒光染料或標(biāo)記物分別偶聯(lián)到不同的抗體上,這些抗體能夠特異性地識別細(xì)胞或組織中的不同蛋白質(zhì)或分子。當(dāng)這些熒光標(biāo)記的抗體與對應(yīng)的抗原結(jié)合時,就會形成抗原-抗體復(fù)合物,并在細(xì)胞或組織上形成熒光標(biāo)記。其次,通過使用不同顏色的熒光標(biāo)記物,可以區(qū)分和定位不同的蛋白質(zhì)或分子。這樣,在同一張細(xì)胞或組織切片上,就可以同時觀察到多種不同的熒光信號,從而實現(xiàn)對多種蛋白質(zhì)或分子的同時檢測和定位。此外,多色免疫熒光技術(shù)還利用了熒光信號的放大技術(shù),如酪氨酸酰胺信號放大(TSA)技術(shù)。這種技術(shù)通過放大熒光信號,使得檢測結(jié)果更加敏感和準(zhǔn)確。上海多色免疫熒光實驗流程