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在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過(guò)單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過(guò)1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有較強(qiáng)度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡廠家有哪些？進(jìn)口激光...

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問(wèn)題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提...

通過(guò)對(duì)微型光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì)，F(xiàn)HIRM-TPM 2.0成像視野擴(kuò)大至420×420平方微米，微型物鏡的工作距離擴(kuò)展至1毫米，以實(shí)現(xiàn)非侵入式成像；嵌入了可拆卸的快速軸向掃描模塊，實(shí)現(xiàn)了180微米深度的三維體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像。該模塊由一個(gè)快速的電動(dòng)變焦透鏡和一對(duì)中繼透鏡組成，在不同深度成像時(shí)保持放大倍率恒定。其中，變焦模塊重量1.8克，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭還可整體即時(shí)拔插，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)動(dòng)物的干擾。在重復(fù)裝卸探頭追蹤同一批神經(jīng)元時(shí)，視場(chǎng)旋轉(zhuǎn)角小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功...

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來(lái)看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料，使其發(fā)出熒光。相比普通光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡運(yùn)用了波長(zhǎng)更短的紫外線，再將可見光過(guò)濾掉，提高了分辨力率。而當(dāng)被檢物體過(guò)厚時(shí)，從不同深度發(fā)出的熒光都會(huì)打在物鏡上，使觀察到的像模糊、發(fā)虛，無(wú)法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu)。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問(wèn)題。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。進(jìn)口ultima2PPLUS雙...

宇宙，浩瀚無(wú)垠，在數(shù)百億光年可觀測(cè)的空間里閃爍著上萬(wàn)億個(gè)星系。人類1400克的大腦,如同一個(gè)小小的宇宙，包含了百億級(jí)神經(jīng)元和百萬(wàn)億級(jí)的神經(jīng)突觸，其結(jié)構(gòu)和功能上極其復(fù)雜而精密的連接，涌現(xiàn)出意識(shí)和思想--大腦小宇宙隱藏著世界上較佳麗較深邃的奧秘。新千年伊始，世界科技強(qiáng)國(guó)紛紛啟動(dòng)有史以來(lái)比較大規(guī)模的腦科學(xué)研究計(jì)劃，人類探索大腦的波瀾壯闊的歷史畫卷正在展開。工欲善其事，必先利其器。目前，各國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃的一個(gè)重要方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動(dòng)態(tài)圖譜的研究工具。其中，如何打破尺度壁壘，整合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)與大腦整體的活動(dòng)和個(gè)體行為信息，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。雙光子顯微鏡已成...

后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用碘化丙啶(PI)來(lái)指示細(xì)胞在7、8、9和10分鐘的延時(shí)觀察后的損傷情況，來(lái)驗(yàn)證該光學(xué)系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞長(zhǎng)期觀察的適用性。在觀察期間，88個(gè)焦點(diǎn)以100毫秒的曝光時(shí)間，曝光間隔1s照射樣品，激發(fā)強(qiáng)度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長(zhǎng)為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s，得到相應(yīng)的(i)-(p)。由圖像可知，延時(shí)觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細(xì)胞損傷，對(duì)于實(shí)際3D延時(shí)成像，由于焦平面是移動(dòng)的，所以預(yù)期細(xì)胞存活時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)，可見這是一種在3D在體延時(shí)成像中具有很...

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過(guò)程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)...

剛好雙光子在這兩點(diǎn)具有很大的優(yōu)勢(shì)在實(shí)際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料，已經(jīng)有做到mm級(jí)別的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-t...

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過(guò)物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過(guò)物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用；美國(guó)激光熒光雙光子顯微鏡分辨率2020年...

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點(diǎn)，何況一臺(tái)儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對(duì)于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，對(duì)樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時(shí)就更容易對(duì)樣品進(jìn)行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過(guò)這個(gè)Z軸的層面，所以對(duì)于空間定點(diǎn)光刺激的實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒(méi)有純紫外進(jìn)行激發(fā)，對(duì)于一些特殊激發(fā)波長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，效率非常低。雙光子顯微鏡的基...

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像，而1997年在Svoboda測(cè)量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動(dòng)態(tài)后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實(shí)驗(yàn)室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強(qiáng)大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場(chǎng)達(dá)到5毫米，能夠跨多個(gè)腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像。根據(jù)清華大學(xué)單一采購(gòu)來(lái)源的**指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場(chǎng)是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來(lái)，雙光子顯微鏡已成為較厚***生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計(jì)了自1990年以來(lái)每年發(fā)...

在傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡中，來(lái)自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整個(gè)樣品的重疊像，沒(méi)有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對(duì)樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力，可以進(jìn)行三維成像、動(dòng)態(tài)成像等。然而，***在濾除雜散光的同時(shí)也將大部分來(lái)自焦平面的熒光濾除了，只有很弱的熒光到達(dá)檢測(cè)器。若要提高信號(hào)強(qiáng)度，需要加大激發(fā)光功率，這又會(huì)導(dǎo)致對(duì)活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢(shì)來(lái)源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)，與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無(wú)須使用***限制光學(xué)散射，其具體優(yōu)勢(shì)如下。雙光子顯微鏡使...

Itrytoexplainwhytwo-photonmicroscopyhasadeeperimagingdepththanone-photonmicroscopy,intheareaofbiomedicalimaging.Manyofthebiomedicalimagingmodalities,nomatterone-photon(confocal)ormulti-photon(two-photon),uselasersaslightsourceandrequirecompatiblefluorescentdyes.Fluorescentdyeshavetheirownexcitationw

雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像，在亞微米級(jí)成像，此功能與目前市場(chǎng)上的共聚焦類顯微鏡性能類似；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí)、在體、原位、無(wú)創(chuàng)地，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像，在無(wú)造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。雙光子顯微鏡技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力，該領(lǐng)域還未形成標(biāo)準(zhǔn)和體系，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐，通過(guò)研究人體基于多光子成像技術(shù)，進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息，找到與疾病的細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、組織病...

許多生物醫(yī)學(xué)成像方式，無(wú)論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子)，都使用激光作為光源，并需要兼容的熒光染料。熒光染料有自己的激發(fā)波長(zhǎng)，它們可以被單個(gè)光子以該激發(fā)波長(zhǎng)的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個(gè)幾乎同時(shí)到達(dá)的光子，但每個(gè)光子的能量約為單光子能量的一半，即雙波長(zhǎng)(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理，后者是雙光子顯微鏡原理。在對(duì)同一種熒光染料進(jìn)行成像時(shí)，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長(zhǎng)，因此雙光子的散射較小(波長(zhǎng)較長(zhǎng)，散射較小)，可以更深入地滲透到組織中。雙光子顯微鏡知多少。激光熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以...

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過(guò)單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過(guò)1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有較強(qiáng)度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡...

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過(guò)程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成...

1.生物組織對(duì)紅外光的吸收弱，對(duì)可見光吸收強(qiáng)。類似的，平時(shí)用手電筒照射手指，會(huì)看到手通透紅亮，也是由于生物組織對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光吸收少。2.生物組織對(duì)紅外光的散射弱。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長(zhǎng)λ的四次方。類似的，早晨的太陽(yáng)非常紅，也就是因?yàn)殚L(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光穿透力更強(qiáng)。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外光比可見光對(duì)生物組織的穿透能力強(qiáng)。與單光子顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）相比，雙光子顯微鏡可以使用約二倍波長(zhǎng)的激光去激發(fā)熒光團(tuán)。長(zhǎng)波長(zhǎng)光束散射程度低(RayleighScattering)，所以穿透能力強(qiáng)。如果已經(jīng)有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺(tái)，只需分光即可。ultimainvestigator雙光子顯微...

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問(wèn)題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來(lái)的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量...

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子過(guò)期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上。即便如此，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對(duì)特殊用途的搭配，改動(dòng)也靈活。好處就是可以鍛煉隊(duì)伍，一趟走下來(lái)可以把新手帶出來(lái)，后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時(shí)候，開始要想方案，后來(lái)要解決各種實(shí)際問(wèn)題。其次是花時(shí)間，加上買配件的時(shí)間，比買一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長(zhǎng)。現(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的...

在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過(guò)單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過(guò)1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有較強(qiáng)度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。優(yōu)勢(shì)來(lái)源于其雙光子光源的非線性光...

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過(guò)程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)...

在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過(guò)單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過(guò)1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有較強(qiáng)度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行光裂解、光轉(zhuǎn)...

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率。雙光子...

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過(guò)程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成...

1.生物組織對(duì)紅外光的吸收弱，對(duì)可見光吸收強(qiáng)。類似的，平時(shí)用手電筒照射手指，會(huì)看到手通透紅亮，也是由于生物組織對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光吸收少。2.生物組織對(duì)紅外光的散射弱。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長(zhǎng)λ的四次方。類似的，早晨的太陽(yáng)非常紅，也就是因?yàn)殚L(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光穿透力更強(qiáng)。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外光比可見光對(duì)生物組織的穿透能力強(qiáng)。與單光子顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）相比，雙光子顯微鏡可以使用約二倍波長(zhǎng)的激光去激發(fā)熒光團(tuán)。長(zhǎng)波長(zhǎng)光束散射程度低(RayleighScattering)，所以穿透能力強(qiáng)。這種雙光子顯微鏡的視場(chǎng)是普通顯微鏡的10倍。美國(guó)雙光子顯微鏡光子躍遷雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用...

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來(lái)的不利影響。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的；進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡光子探測(cè)Denk很快...

許多生物醫(yī)學(xué)成像方式，無(wú)論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子)，都使用激光作為光源，并需要兼容的熒光染料。熒光染料有自己的激發(fā)波長(zhǎng)，它們可以被單個(gè)光子以該激發(fā)波長(zhǎng)的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個(gè)幾乎同時(shí)到達(dá)的光子，但每個(gè)光子的能量約為單光子能量的一半，即雙波長(zhǎng)(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理，后者是雙光子顯微鏡原理。在對(duì)同一種熒光染料進(jìn)行成像時(shí)，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長(zhǎng)，因此雙光子的散射較小(波長(zhǎng)較長(zhǎng)，散射較小)，可以更深入地滲透到組織中。由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究。國(guó)內(nèi)investigator雙光子顯微鏡...

1.生物組織對(duì)紅外光的吸收弱，對(duì)可見光吸收強(qiáng)。類似的，平時(shí)用手電筒照射手指，會(huì)看到手通透紅亮，也是由于生物組織對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光吸收少。2.生物組織對(duì)紅外光的散射弱。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長(zhǎng)λ的四次方。類似的，早晨的太陽(yáng)非常紅，也就是因?yàn)殚L(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光穿透力更強(qiáng)。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外光比可見光對(duì)生物組織的穿透能力強(qiáng)。與單光子顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）相比，雙光子顯微鏡可以使用約二倍波長(zhǎng)的激光去激發(fā)熒光團(tuán)。長(zhǎng)波長(zhǎng)光束散射程度低(RayleighScattering)，所以穿透能力強(qiáng)。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被發(fā)動(dòng)，所以雙光子成像更清晰。進(jìn)口2PPL...

許多生物醫(yī)學(xué)成像方式，無(wú)論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子)，都使用激光作為光源，并需要兼容的熒光染料。熒光染料有自己的激發(fā)波長(zhǎng)，它們可以被單個(gè)光子以該激發(fā)波長(zhǎng)的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個(gè)幾乎同時(shí)到達(dá)的光子，但每個(gè)光子的能量約為單光子能量的一半，即雙波長(zhǎng)(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理，后者是雙光子顯微鏡原理。在對(duì)同一種熒光染料進(jìn)行成像時(shí)，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長(zhǎng)，因此雙光子的散射較小(波長(zhǎng)較長(zhǎng)，散射較小)，可以更深入地滲透到組織中。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子。美國(guó)熒光雙光子顯微鏡成像...