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溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理

來源： 發(fā)布時(shí)間：2024-06-20

RIP實(shí)驗(yàn)步驟通常包括：
1. 細(xì)胞收集與交聯(lián)：培養(yǎng)細(xì)胞至適當(dāng)密度。使用交聯(lián)劑（如甲醛）進(jìn)行交聯(lián)，以固定蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
2. 細(xì)胞裂解：收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解，釋放RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在裂解過程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。
3. 超聲處理：使用超聲波破壞細(xì)胞，獲得更小的染色質(zhì)片段，這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。
4. 除去細(xì)胞碎片：通過離心去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞，收集含RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的上清液。
5. 免疫沉淀：將針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白（RBP）的抗體加入到上清液中。孵育一段時(shí)間，使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。
6. 捕獲免疫復(fù)合物：添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物與珠子結(jié)合。
7. 洗滌：多次洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
8. 洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫免疫復(fù)合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，釋放RNA。
9. RNA提取與純化：從免疫沉淀樣品中提取RNA，并進(jìn)行純化。
10. RNA分析：使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA，以確定與目標(biāo)蛋白相互作用的RNA種類。
免疫沉淀技術(shù)RIP的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理

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RIP 技術(shù)的原理（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀）主要是運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，經(jīng)過分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測(cè)序分析。

RIP 是研究細(xì)胞內(nèi)RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對(duì)象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同，如：RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等。
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免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)特性的重要方法。它具有一些明顯的優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些局限性。
優(yōu)點(diǎn):
1. 特異性強(qiáng)：IP技術(shù)利用特異性抗體對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行捕獲，因此具有很高的特異性。
2. 富集低豐度蛋白：可以從小量樣本中富集低豐度的目標(biāo)蛋白，有助于研究稀有蛋白。
3. 研究蛋白質(zhì)相互作用：通過Co-IP等變體技術(shù)，可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。
4. 操作簡(jiǎn)便：IP實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，容易在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施。

缺點(diǎn):
1. 對(duì)抗體質(zhì)量依賴性高：需要高質(zhì)量的特異性抗體，否則可能導(dǎo)致假陽性或?qū)嶒?yàn)失敗。
2. 存在非特異性結(jié)合：樣本中的其他蛋白質(zhì)可能非特異性地結(jié)合到抗體或固相載體上。
3. 可能破壞蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象：裂解和洗滌步驟可能破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，影響其功能。
4. 可能存在背景噪聲：非特異性結(jié)合可能導(dǎo)致背景噪聲，影響結(jié)果的清晰度和解釋。

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu)，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡(jiǎn)而言之，瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng)，而磁珠在得率，可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。
免疫沉淀技術(shù)IP的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？

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Co-IP（免疫共沉淀）技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：
1. 樣品準(zhǔn)備：Co-IP實(shí)驗(yàn)通常有兩種，一種是內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證，一種是非內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證。內(nèi)源性相互作用通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方式將兩種蛋白轉(zhuǎn)染至同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；非內(nèi)源性相互作用則是將含有靶蛋白的組織進(jìn)行預(yù)處理及細(xì)胞裂解獲得細(xì)胞裂解液。
2. 沉淀誘餌蛋白：利用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白。在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體，抗體會(huì)與誘餌蛋白結(jié)合，利用磁鐵將磁珠拉下，同時(shí)誘餌蛋白會(huì)一起被沉淀出來。
3. SDS-PAGE及WB檢測(cè)：得到沉淀后，需要驗(yàn)證沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE將蛋白復(fù)合物分離，隨后利用WB檢測(cè)是否存在靶蛋白。
4. 實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置：為了避免“假陽性”，需要設(shè)置正確的對(duì)照，包括陰性對(duì)照和陽性對(duì)照（Input組）。Input組為直接利用抗體對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB檢測(cè)，驗(yàn)證細(xì)胞裂解液中存在蛋白。
5. 結(jié)果真實(shí)性：確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白。使用單克隆抗體有助于避免污染的發(fā)生。
免疫沉淀技術(shù)ChIP的實(shí)驗(yàn)方法。蘇州Co IP免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠

免疫沉淀技術(shù)是什么？溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理

免疫沉淀IP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu)，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡(jiǎn)而言之，瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng)，而磁珠在得率，可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。
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標(biāo)簽： 支原體 免疫沉淀