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溫州anti DYKDDDDK免疫沉淀磁珠應(yīng)用

來源： 發(fā)布時間：2024-07-16

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)不同于WB實(shí)驗(yàn)的樣品制備，對實(shí)驗(yàn)樣品制備要求更高，除了要控制所有操作盡量在冰上完成外，關(guān)鍵的是裂解液的成分，裂解液成分直接決定了樣品質(zhì)量。
主要影響：
1. 蛋白的釋放：許多目的蛋白定位在細(xì)胞器，質(zhì)膜，細(xì)胞核，細(xì)胞骨架中，但通常這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)很難被裂解液有效溶解，所以很難將這些蛋白釋放出來。
2. 蛋白相互作用：不同去垢劑對不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)間相互作用影響程度不同，一些互作較弱的蛋白對盡管在比較溫和的裂解液配方中仍然會被破壞。
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免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵，因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。
1. 特異性：抗體應(yīng)當(dāng)對目標(biāo)蛋白具有高度的特異性，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2. 親和力：抗體對目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高，以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型：單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證：選擇已經(jīng)過免疫沉淀（Co-IP）或相關(guān)應(yīng)用（如Western blot, IHC）驗(yàn)證的抗體，這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息：選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商，并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價，以幫助做出決策。
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“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的結(jié)合蛋白，進(jìn)行小規(guī)模的蛋白質(zhì)親和純化的實(shí)驗(yàn)。更確切地說，IP是采用固定在微珠支持物(一般是瓊脂糖樹脂)上的特定抗體，從復(fù)雜的混合物中，純化單一抗原的實(shí)驗(yàn)。固定化蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝既可以分步進(jìn)行，也可以一步完成。

常見的加樣順序：抗體和樣本(如細(xì)胞裂解物)一起孵育，然后加入親和微珠，用于捕獲抗體-抗原復(fù)合物。也可以將抗體和微珠(通過抗體結(jié)合蛋白，如蛋白A、G或A/G等，直接或間接結(jié)合抗體)先進(jìn)行孵育，然后再加入含有抗原的樣本。當(dāng)抗原、抗體和固相支持物產(chǎn)生結(jié)合以后，充分洗滌微珠，再采用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液從支持物上洗脫抗原。

真核生物的基因組 DNA 以染色質(zhì)（Chromatin）的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與 DNA 在染色質(zhì)環(huán)境中的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑，而染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation，ChIP）技術(shù)是目前公認(rèn)的研究此相互作用的選擇，是真核生物基因表達(dá)機(jī)制研究中不可或缺的技術(shù)之一。
它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下，固定蛋白質(zhì)-DNA（染色質(zhì)）復(fù)合物，并將其切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法（抗體親和）沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA，通過對目的片段的純化與后期檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。
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免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation，簡稱IP）是一種生物化學(xué)方法，它利用特異性抗體對抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads（預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上），根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性，形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物，清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白，檢測是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測方法檢測的蛋白質(zhì)。
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RNA免疫沉淀技術(shù)（RIP）是一種研究RNA與蛋白質(zhì)相互作用的重要方法，其應(yīng)用領(lǐng)域主要包括：
1. 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究：RIP技術(shù)可以幫助研究者了解RNA在轉(zhuǎn)錄后水平如何被調(diào)控。
2. 表觀遺傳調(diào)控：RIP技術(shù)用于研究RNA結(jié)合蛋白（RBPs）在表觀遺傳調(diào)控中的作用。
3. 非編碼RNA功能研究：RIP技術(shù)可以用來研究長非編碼RNA（lncRNA）、miRNA和其他小RNA的種類，以及它們?nèi)绾闻c蛋白質(zhì)相互作用來調(diào)控基因表達(dá)。
4. RNA病毒研究：RIP技術(shù)也可用于研究RNA病毒與其宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用，進(jìn)而了解病毒復(fù)制和致病機(jī)制。
5. RNA修飾和甲基化研究：RIP技術(shù)結(jié)合其他技術(shù)如m5C-RIP-seq，可用于研究RNA甲基化修飾及其在病理過程中的作用。
6. RNA定位和穩(wěn)定性：通過RIP技術(shù)，研究者可以探索特定RNA在細(xì)胞內(nèi)的定位以及它們?nèi)绾伪环€(wěn)定或降解。
7. RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的鑒定：RIP技術(shù)可以用來鑒定與特定RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而揭示RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成。
8. 疾病相關(guān)RNA研究：RIP技術(shù)在疾病相關(guān)RNA的研究中也有應(yīng)用。
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標(biāo)簽： 免疫沉淀 支原體