支原體污染和黑膠蟲污染是兩種不同類型的細胞培養(yǎng)污染,它們具有各自的特點和區(qū)別:
支原體污染:在相差顯微鏡下,支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。
黑膠蟲污染:在高倍鏡下,被黑膠蟲污染的細胞膜會變得模糊不清,邊界不清晰,有粗糙感。
污染的影響:
支原體污染:可能導致細胞增殖緩慢,甚至從培養(yǎng)器皿脫落,影響細胞的DNA、RNA及蛋白表達。
黑膠蟲污染:與細胞競爭性生長,開始時對細胞沒有什么影響,但當數(shù)量多時,細胞生長會受到影響直至死亡。
污染的來源:
支原體污染:可能來源于工作環(huán)境的污染、操作者本身、培養(yǎng)基的污染、交叉污染、實驗器材帶來的污染以及用來制備細胞的原始組織或部位的污染。
黑膠蟲污染:可能來源于細胞本身的污染或從動物取材時的污染,也可能通過培養(yǎng)箱空氣進行污染。
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細胞培養(yǎng)中支原體污染的檢測方法有多種,以下是一些常用的檢測手段:
1. 顯微鏡檢測:通過相差顯微鏡觀察細胞,支原體在細胞表面和細胞之間會呈現(xiàn)為暗色微小顆粒。
2. 熒光染色法:使用熒光染料Hoechst 33258與DNA特異性結(jié)合,使支原體的DNA著色,然后在熒光顯微鏡下觀察。染色后的支原體會在細胞周圍或附于細胞膜表面顯示為亮綠色小點。
3. 電鏡檢查:使用掃描電鏡或透射電鏡觀察,這是一種簡便快速的方法。
4. 聚合酶鏈反應(PCR):使用特定的引物對支原體DNA進行擴增,是一種高靈敏度的檢測方法。
5. 等溫擴增法:基于LAMP技術,室溫反應后觀察顏色變化確認是否有支原體污染。
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支原體去除的實驗步驟通常包括以下幾個階段:
1. 支原體檢測:在進行去除之前,首先要確認細胞培養(yǎng)物是否受到支原體污染。這可以通過多種方法實現(xiàn),如PCR法、LAMP法或支原體培養(yǎng)法。
2. 選擇合適的去除試劑:一旦確認存在支原體污染,需要選擇一種有效的去除試劑。
3. 去除試劑的添加:根據(jù)去除試劑的說明書,將試劑添加到受污染的細胞培養(yǎng)基中。通常,這涉及到將一定比例的去除試劑加入到細胞培養(yǎng)液中。
4. 孵育:添加去除試劑后,將細胞培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱中孵育。孵育時間和條件(如溫度、CO2濃度)應根據(jù)試劑的推薦進行調(diào)整。
5. 監(jiān)測去除效果:在孵育過程中,定期監(jiān)測細胞的狀態(tài)和去除效果。這可能包括觀察細胞形態(tài)、生長速率的變化,以及通過顯微鏡檢查是否有支原體存在的跡象。
6. 后續(xù)檢測:去除過程完成后,再次使用支原體檢測方法確認污染是否已被成功。
根據(jù)提供的信息,支原體去除試劑是一種混合制劑,通過抑制DNA和支原體生長所必須的相關蛋白合成來取得良好的支原體清*效果,同時對細胞無傷害。它被設計為對細胞毒性小,不影響后續(xù)的細胞實驗,包括細胞活力檢測和細胞轉(zhuǎn)染等。這表明使用支原體去除試劑去除支原體后,理論上不應該對細胞的轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生負面影響。
此外,支原體污染本身會對細胞的轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生負面影響。研究表明,與未污染的細胞相比,支原體污染的細胞轉(zhuǎn)染后具有較低的基因表達水平。因此,去除支原體后,可以預期細胞的轉(zhuǎn)染效率會得到改善,因為移除了影響細胞正常功能的污染物。
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細胞培養(yǎng)中建議使用支原體檢測的原因主要有以下幾點:
1. 支原體污染率高:常規(guī)細胞培養(yǎng)中支原體污染率保守估計在15-35%之間。
2. 影響實驗結(jié)果:支原體污染會嚴重干擾實驗結(jié)果的可信度,影響培養(yǎng)細胞的形態(tài)和生理特征。
3. 難以用光學顯微鏡檢測:支原體是極小的細菌,其細胞膜周圍沒有細胞壁,無法用光學顯微鏡檢測到。
4. 難以消滅:支原體能夠迅速滲透整個實驗室,一旦污染很難徹底消滅。
5. 影響產(chǎn)品質(zhì)量:支原體污染會影響細胞培養(yǎng)產(chǎn)物的質(zhì)量,監(jiān)管機構(gòu)推薦檢測所有細胞培養(yǎng)產(chǎn)物中是否存在支原體。
6. 保證實驗準確性:定期進行支原體檢測和去除,確保無支原體存在細胞培養(yǎng)體系內(nèi),才能獲得準確的實驗結(jié)果。
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細胞培養(yǎng)中支原體難以徹底消滅的原因主要包括以下幾點:
1. 無細胞壁結(jié)構(gòu):支原體是沒有細胞壁的微生物,這使得許多作用于細胞壁的抗*素對支原體無效。
2. 微小體積:支原體體積小,能夠穿過常規(guī)的除菌濾膜,例如0.20微米甚至0.10微米的濾膜。
3. 隱匿性:支原體污染初期很難被察覺,它們在普通光學顯微鏡下幾乎不可見,因此細胞被支原體污染后,前期很難被發(fā)現(xiàn)。
4. 傳播途徑多樣:支原體可以通過細胞培養(yǎng)物、細胞懸液、細胞培養(yǎng)用具等途徑迅速傳播。
5. 污染源 :支原體污染源包括細胞間的交叉污染、操作人員的口腔、皮膚,以及細胞培養(yǎng)用的組分如血清、培養(yǎng)液等。
6. 環(huán)境因素:實驗室環(huán)境、試驗臺、超凈臺、培養(yǎng)箱等可能被支原體污染,引起細胞的污染。
7. 抗*素耐藥性:支原體可能對某些抗*素產(chǎn)生耐藥性,使得治*效果變差。
8. 檢測和清理方法的局限性:一些傳統(tǒng)的支原體檢測和清理方法可能不夠靈敏或有效,導致難以徹底清理支原體
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