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南京Co IP免疫沉淀技術服務

來源： 發(fā)布時間：2024-07-25

免疫沉淀技術（Immunoprecipitation，簡稱IP）是一種生物化學方法，它利用特異性抗體對抗原進行親和純化。在含有目的抗原的細胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads（預先將Protein A/G固定結合在磁珠上），根據抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性，形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復合物，清洗離心后去除溶液中未結合的雜蛋白，檢測是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技術常用于從細胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術的蛋白和其他生物分子。它的目標是分離足夠用于Western Blot或其他檢測方法檢測的蛋白質。
免疫沉淀技術ChIP的實驗方法。南京Co IP免疫沉淀技術服務

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真核生物的基因組 DNA 以染色質（Chromatin）的形式存在。因此，研究蛋白質與 DNA 在染色質環(huán)境中的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑，而染色質免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation，ChIP）技術是目前公認的研究此相互作用的選擇，是真核生物基因表達機制研究中不可或缺的技術之一。
它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下，固定蛋白質-DNA（染色質）復合物，并將其切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過免疫學方法（抗體親和）沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的 DNA，通過對目的片段的純化與后期檢測，從而獲得蛋白質與 DNA 相互作用的信息。
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免疫沉淀（IP）實驗中抗體的選擇非常關鍵，因為抗體的特異性和親和力直接影響到實驗的成功與否。
1. 特異性：抗體應當對目標蛋白具有高度的特異性，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結合，導致假陽性結果。
2. 親和力：抗體對目標蛋白的親和力要足夠高，以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標蛋白。
3. 抗體類型：單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實驗。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強的結合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應用驗證：選擇已經過免疫沉淀（IP）或相關應用（如Western blot, IHC）驗證的抗體，這增加了實驗成功的可能性。
5. 供應商信息：選擇信譽良好的抗體供應商，并查看供應商提供的技術數(shù)據和客戶評價，以幫助做出決策。

RIP實驗步驟通常包括：
1. 細胞收集與交聯(lián)：培養(yǎng)細胞至適當密度。使用交聯(lián)劑（如甲醛）進行交聯(lián)，以固定蛋白質-RNA復合物。
2. 細胞裂解：收集細胞并進行裂解，釋放RNA-蛋白質復合物。在裂解過程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質降解。
3. 超聲處理：使用超聲波破壞細胞，獲得更小的染色質片段，這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。
4. 除去細胞碎片：通過離心去除細胞碎片和未裂解的細胞，收集含RNA-蛋白質復合物的上清液。
5. 免疫沉淀：將針對特定RNA結合蛋白（RBP）的抗體加入到上清液中。孵育一段時間，使抗體與目標蛋白充分結合。
6. 捕獲免疫復合物：添加蛋白A或蛋白G結合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質-RNA復合物與珠子結合。
7. 洗滌：多次洗滌珠子以去除未特異性結合的蛋白質和RNA。
8. 洗脫與逆轉交聯(lián)：使用適當?shù)木彌_液洗脫免疫復合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉交聯(lián)，釋放RNA。
9. RNA提取與純化：從免疫沉淀樣品中提取RNA，并進行純化。
10. RNA分析：使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA，以確定與目標蛋白相互作用的RNA種類。
免疫沉淀Co-IP技術選瓊脂糖珠還是磁珠？

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ChIP（染色質免疫沉淀）實驗是一種用于研究蛋白質與DNA相互作用的技術。以下是ChIP實驗的實驗方法概述：
1. 交聯(lián)：將細胞與交聯(lián)劑（如1%甲醛）孵育，通常在室溫下進行10-15分鐘。
2. 終止交聯(lián)：添加甘氨酸以終止交聯(lián)反應，孵育5分鐘。
3. 收集細胞：通過離心收集細胞，并用PBS洗滌以去除交聯(lián)劑。
4. 細胞裂解：使用裂解緩沖液裂解細胞，釋放染色質。
5. 染色質剪切：使用超聲波或酶消化將染色質剪切成適當大小的片段。
6. 免疫沉淀：將剪切后的染色質與特異性抗體孵育，然后添加蛋白A/G磁珠。
7. 洗滌：用低鹽、高鹽和LiCl洗滌液洗滌磁珠，去除非特異性結合物。
8. 洗脫：用洗脫緩沖液洗脫DNA。
9. 逆轉交聯(lián)：用蛋白酶K處理，然后在65°C下加熱過夜以逆轉交聯(lián)。
10. DNA純化：使用商業(yè)試劑盒或標準酚/氯仿方法純化DNA。
11. 分析：使用qPCR分析富集的DNA，或進行測序以確定蛋白質結合位點。
免疫沉淀技術ChIP是什么？南京RIP免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠

免疫沉淀技術ChIP實驗步驟。南京Co IP免疫沉淀技術服務

免疫沉淀Co-IP實驗中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實驗情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結構  (直徑 50-150 μm)  可以結合抗體  (繼而結合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設備。瓊脂糖珠呈多孔結構，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質相互接觸，具有更高的結合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結合表面積滿足高容量的抗體結合。
簡而言之，瓊脂糖珠的結合能力較強，而磁珠在得率，可重復性以及自動化方面有明顯的優(yōu)勢。
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