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上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理

來源： 發(fā)布時間：2024-07-31

免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation，簡稱IP）是一種生物化學(xué)方法，它利用特異性抗體對抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads（預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上），根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性，形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物，清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白，檢測是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測方法檢測的蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)IP的原理是什么？上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理

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Co-IP（免疫共沉淀）技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，其實驗設(shè)計如下：
1. 樣品準(zhǔn)備：Co-IP實驗通常有兩種，一種是內(nèi)源性蛋白相互作用驗證，一種是非內(nèi)源性蛋白相互作用驗證。內(nèi)源性相互作用通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方式將兩種蛋白轉(zhuǎn)染至同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；非內(nèi)源性相互作用則是將含有靶蛋白的組織進(jìn)行預(yù)處理及細(xì)胞裂解獲得細(xì)胞裂解液。
2. 沉淀誘餌蛋白：利用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白。在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體，抗體會與誘餌蛋白結(jié)合，利用磁鐵將磁珠拉下，同時誘餌蛋白會一起被沉淀出來。
3. SDS-PAGE及WB檢測：得到沉淀后，需要驗證沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE將蛋白復(fù)合物分離，隨后利用WB檢測是否存在靶蛋白。
4. 實驗對照設(shè)置：為了避免“假陽性”，需要設(shè)置正確的對照，包括陰性對照和陽性對照（Input組）。Input組為直接利用抗體對細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB檢測，驗證細(xì)胞裂解液中存在蛋白。
5. 結(jié)果真實性：確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白。使用單克隆抗體有助于避免污染的發(fā)生。
ChIP免疫沉淀磁珠的選擇免疫沉淀的原理是什么？

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免疫沉淀技術(shù)的實驗方法通常包括以下步驟：
1. 樣本準(zhǔn)備
2. 細(xì)胞裂解：使用裂解緩沖液（含有蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解）裂解細(xì)胞，釋放蛋白質(zhì)。
3. 蛋白質(zhì)濃度測定：使用BCA、Bradford或Lowry等方法測定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。
4. 抗體預(yù)處理：如果使用預(yù)固定的抗體，需先將抗體固定在固相支持物上，如瓊脂糖珠或磁性微珠。
5. 免疫沉淀反應(yīng)：將裂解液與特異性抗體（固定或未固定）混合，并在4°C下緩慢搖晃孵育過夜，以允許抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)充分結(jié)合。
6. 固相支持物的回收：對于未固定的抗體，加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。
7. 洗滌：去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，通常需要多次洗滌固相支持物。
8. 洗脫：使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液（如加熱的SDS加載緩沖液或酸性緩沖液）從固相支持物上洗脫免疫復(fù)合物。
9. 后續(xù)分析：對洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳、Western Blot、質(zhì)譜分析等，以進(jìn)一步分析目標(biāo)蛋白質(zhì)。
10. 對照實驗：包括正對照（已知能沉淀目標(biāo)蛋白的抗體）和負(fù)對照（非特異性抗體或無抗體）以驗證實驗的特異性。

免疫共沉淀分析（Co-IP）與IP十分類似，基本的技術(shù)都是采用目標(biāo)抗原特異性的固相化抗體；但I(xiàn)P的目標(biāo)是純化單一抗原，而Co-IP旨在分離抗原及與抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)或配體。

在Co-IP實驗中，已知抗原稱為誘餌蛋白，與之結(jié)合的蛋白則稱為靶蛋白。靶蛋白可能是一些復(fù)雜的伴侶蛋白、信號分子、結(jié)構(gòu)蛋白、輔助因子等，蛋白間相互作用強度范圍可能介于高度瞬時和十分穩(wěn)定之間。
基本的Co-IP實驗方案與IP相同，實際上任何IP系統(tǒng)均可用于Co-IP。但是，還有許多其他因素需要考慮，例如，結(jié)合和洗滌條件的優(yōu)化，優(yōu)化時，需要考慮到誘餌蛋白-靶蛋白的相互作用強度以及抗體-誘餌蛋白的親和力。
免疫沉淀技術(shù)IP的應(yīng)用有哪些？

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免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）的實驗步驟通常包括以下幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：
1. 細(xì)胞裂解：首先需要收集細(xì)胞并裂解它們，以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。這通常通過添加含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液來完成，以防止蛋白質(zhì)降解。
2. 裂解物上清：裂解后的細(xì)胞混合物通常需要通過離心來去除未破碎的細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞，從而獲得上清。
3. 抗體的添加：將特定于目標(biāo)蛋白的抗體加入到裂解物中。這些抗體將特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白上。
4. 免疫復(fù)合物的形成：抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物。
5. 免疫復(fù)合物的捕獲：使用Protein A/G結(jié)合的磁珠來捕獲免疫復(fù)合物。
6. 洗滌：捕獲免疫復(fù)合物后，需要用裂解/洗滌緩沖液多次洗滌，以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他污染物。
7. 洗脫：免疫復(fù)合物可以通過加入SDS樣品緩沖液進(jìn)行洗脫，這將導(dǎo)致抗體和抗原變性并從珠子上釋放下來，或者使用低pH緩沖液進(jìn)行溫和洗脫，以保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。
8. 分析：洗脫后的樣品可以通過SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot等方法進(jìn)行分析，以驗證目標(biāo)蛋白的存在和狀態(tài)。
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免疫沉淀技術(shù)IP實驗步驟。上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理

免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)特性的重要方法。它具有一些明顯的優(yōu)點，但也存在一些局限性。
優(yōu)點:
1. 特異性強：IP技術(shù)利用特異性抗體對目標(biāo)蛋白進(jìn)行捕獲，因此具有很高的特異性。
2. 富集低豐度蛋白：可以從小量樣本中富集低豐度的目標(biāo)蛋白，有助于研究稀有蛋白。
3. 研究蛋白質(zhì)相互作用：通過Co-IP等變體技術(shù)，可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。
4. 操作簡便：IP實驗步驟相對簡單，容易在實驗室中實施。

缺點:
1. 對抗體質(zhì)量依賴性高：需要高質(zhì)量的特異性抗體，否則可能導(dǎo)致假陽性或?qū)嶒炇　?
2. 存在非特異性結(jié)合：樣本中的其他蛋白質(zhì)可能非特異性地結(jié)合到抗體或固相載體上。
3. 可能破壞蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象：裂解和洗滌步驟可能破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，影響其功能。
4. 可能存在背景噪聲：非特異性結(jié)合可能導(dǎo)致背景噪聲，影響結(jié)果的清晰度和解釋。

上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理

標(biāo)簽： 支原體 免疫沉淀