蛋白免疫沉淀(proteinimmunoprecipitation)是一種常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù),用于分離和富集特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物。該技術(shù)基于抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合,通過沉淀和洗滌步驟將目標(biāo)蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來。蛋白免疫沉淀廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中,可以用于研究蛋白質(zhì)的相互作用、鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、研究蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)等。蛋白免疫沉淀的基本原理是利用抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合。首先,需要選擇合適的抗體,該抗體可以特異性地結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)。免疫沉淀技術(shù)Co-IP的原理是什么?北京RIP免疫沉淀磁珠貨期
沉淀劑與抗體結(jié)合,形成復(fù)合物,然后通過離心或磁力分離的方法將復(fù)合物從混合物中分離出來。洗滌是為了去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。洗滌液通常包含高鹽濃度和洗滌緩沖液,以增加特異性結(jié)合的穩(wěn)定性,并去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。,分離和分析沉淀的蛋白質(zhì)。這可以通過熱變性、酸性或堿性條件來實(shí)現(xiàn)。分離的蛋白質(zhì)可以通過SDS-PAGE、Westernblotting、質(zhì)譜等技術(shù)進(jìn)行分析和鑒定。蛋白免疫沉淀技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。廣州Protein AG免疫沉淀磁珠原理免疫沉淀Co-IP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠?
免疫沉淀是探索細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜分子互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的重要方法。在細(xì)胞代謝的研究中,它幫助我們了解關(guān)鍵酶與其他調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用。例如,在糖代謝過程中,通過免疫沉淀特定的糖代謝酶,可以發(fā)現(xiàn)與之結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的蛋白質(zhì),從而揭示細(xì)胞如何精細(xì)調(diào)控代謝途徑以適應(yīng)不同的生理需求。對于神經(jīng)生物學(xué)的研究,免疫沉淀同樣具有重要價(jià)值。神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞依賴于一系列蛋白質(zhì)的協(xié)同作用,通過免疫沉淀相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)受體或信號(hào)蛋白,可以揭示神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)過程中的分子機(jī)制,為理解神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病的發(fā)展提供深入的見解。而且,免疫沉淀在研究細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界壓力,如氧化應(yīng)激或熱休克時(shí),會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)激蛋白。通過免疫沉淀這些應(yīng)激蛋白及其相互作用伙伴,可以闡明細(xì)胞的應(yīng)激防御機(jī)制和適應(yīng)性反應(yīng)。
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu) (直徑 50-150 μm) 可以結(jié)合抗體 (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng),而磁珠在得率,可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢。
免疫沉淀IP抗體的選擇?
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)的實(shí)驗(yàn)方法通常包括以下步驟:
1. 樣本準(zhǔn)備
2. 蛋白質(zhì)濃度測定:使用BCA、Bradford或Lowry等方法測定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。
3. 抗體預(yù)處理:如果使用預(yù)固定的抗體,需先將抗體固定在固相支持物上,如瓊脂糖珠或磁性微珠。
4. 免疫沉淀反應(yīng):將裂解液與特異性抗體(固定或未固定)混合,并在4°C下緩慢搖晃孵育過夜,以允許抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)充分結(jié)合。
5. 固相支持物的回收:對于未固定的抗體,加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。
6. 洗滌:去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì),通常需要多次洗滌固相支持物。
7. 洗脫:使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液(如加熱的SDS加載緩沖液或酸性緩沖液)從固相支持物上洗脫免疫復(fù)合物。
8. 后續(xù)分析:對洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳、Western Blot、質(zhì)譜分析等,以進(jìn)一步分析目標(biāo)蛋白質(zhì)。
免疫沉淀和免疫共沉淀的區(qū)別?廣州蛋白免疫沉淀磁珠多少錢
免疫沉淀技術(shù)IP是什么?北京RIP免疫沉淀磁珠貨期
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟:
1. 目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇:
2. 抗體的選擇:選擇特異性強(qiáng)、親和力高的抗體來捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)
3. 樣本的準(zhǔn)備:收集和準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。
4. 蛋白質(zhì)的裂解和釋放:選擇合適的裂解條件,如pH值、離子強(qiáng)度、去污劑等。
5. 蛋白質(zhì)濃度的測定:確定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度,以便于后續(xù)步驟的標(biāo)準(zhǔn)化。
6. 免疫沉淀的操作:將特異性抗體與裂解液混合,并在適宜的條件下孵育,以形成抗體-抗原復(fù)合物。
7. 非特異性結(jié)合的減少:通過預(yù)純化步驟去除可能的非特異性結(jié)合蛋白。
8. 洗滌:多次洗滌以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。
9. 目標(biāo)蛋白質(zhì)的洗脫:使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫抗體-抗原復(fù)合物。
10. 后續(xù)分析:對洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析,如Western Blot.
11. 對照實(shí)驗(yàn):設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)恼龑φ蘸拓?fù)對照,以評估實(shí)驗(yàn)的特異性和敏感性。
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