不論在科研還是臨床中，CRISPR技術(shù)的使用都帶來了非常高的回報，也同時伴隨著各種風險，這其中脫靶現(xiàn)象就研究者們較為擔心的一類風險。本文中我們盤點了多種主流的CRISPR脫靶位點檢測方法，但沒有一種方法是適用于所有CRISPR技術(shù)的脫靶檢測，一個項目中只使用一種脫靶檢測方法也是不足夠的。如何在實驗中，特別是臨床試驗中多方面評估CRISPR的脫靶風險，需要將多種脫靶檢測方法有效組合。同時，每一條sgRNA都不可避免地存在脫靶位點，如何評估這種風險，如何降低這種風險，具體的解決方案我們用臨床實例來為大家介紹。脫靶檢測政策，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準確率高。上海育種脫靶檢測guide-sequence

gRNA的長度和錯配： 17個核苷酸長度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類細胞中減少潛在脫靶效應(yīng)的指導(dǎo)方針：1) 應(yīng)避免在PAM的7-10 bp范圍內(nèi)靶序列有超過3個錯配；2) 在PAM的12 bp內(nèi)，應(yīng)避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應(yīng)。gRNA的化學修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦?；宜狨?dǎo)致位點特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時保持靶向性能。gRNA上游5'發(fā)夾結(jié)構(gòu)的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應(yīng)。深圳crispr/cas9脫靶檢測技術(shù)種子脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準確率高。

基于已有科學經(jīng)驗和既往非臨床/臨床研究結(jié)果，如果認為基因修飾細胞所采用的載體系統(tǒng)可將外源基因整合到細胞基因組中并可在體內(nèi)長期存續(xù)，需綜合分析以上風險因素，評估潛在的插入突變、致瘤/致性風險。非臨床研究，應(yīng)采用具有代表性的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞進行基因整合位點分析，分析細胞的克隆組成以及在關(guān)注基因（如liu相關(guān)調(diào)控基因）附近有無優(yōu)先整合跡象，含有關(guān)注整合位點的細胞有無優(yōu)先異常增殖。對于嵌合抗原受體（Chimericantigenreceptor，CAR）或T細胞受體（Tcellreceptor，TCR）修飾的免疫細胞，應(yīng)盡可能采用多種方法評估其靶點相關(guān)毒性和脫靶毒性風險。

CIRCLE-seq和CHANGE-seq與SITE-seq同期發(fā)表的CIRCLE-seq一定程度上解決了SITE-seq的一些問題。CIRCLE-seq的第一步是將純化后的基因組DNA隨機打斷成300bp左右的片段，然后首尾相連成環(huán)狀DNA，這種方法很好地避免了DNA隨機斷裂造成的背景噪聲。實驗的第二步是用Cas9切割環(huán)狀DNA，再連上接頭并進行雙端測序，這樣就可以在一次測序中同時獲取切割位點的兩側(cè)序列，彌補了SITE-seq的另一個缺點。CIRCLE-seq從總體上來說要優(yōu)于SITE-seq，但是將基因組DNA隨機打斷后成環(huán)的效率并不高，所以同一作者在3年后發(fā)表了CHANGE-seq，用Tn5一步法打斷基因組并加接頭，提高了成環(huán)效率，降低了起始基因組DNA的用量。基因療法脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準確率高。

對于基因修飾細胞zhiliao產(chǎn)品，充分的非臨床研究是為了：（1）闡明基因修飾的目的、功能以及產(chǎn)品的作用機制，明確其在擬定患者人群中使用的生物學合理性；（2）為臨床試驗的給藥途徑、給藥程序、給藥劑量的選擇提供支持性依據(jù)；（3）根據(jù)潛在風險因素，闡明毒性反應(yīng)特征，預(yù)測人體可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，確定不良反應(yīng)的臨床監(jiān)測指標，為制定臨床風險控制措施提供參考依據(jù)。因此，應(yīng)充分開展非臨床研究，收集用于風險獲益評估的信息，以確立擬開發(fā)產(chǎn)品在目標患者人群中預(yù)期具有合理的、可接受的獲益風險比，同時為臨床試驗的設(shè)計和風險控制策略的制定提供支持性依據(jù)。脫靶檢測安全性評價，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準確率高。杭州種子基因脫靶檢測技術(shù)

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Guide-seq原理圖，Discover-seq細胞內(nèi)的脫靶切割一般無法直接捕獲，除了Guide-seq這種連接dsODN來間接記錄脫靶位點的方法外，研究者們還想出一種蛋白介導(dǎo)的方法Discover-seq。由于DNA雙鏈斷裂后細胞會啟動DNA修復(fù)機制，大量蛋白參與到斷裂處的修復(fù)，所以研究者就對相關(guān)蛋白進行篩選，找到其中MRE11結(jié)合DNA的位點與DNA雙鏈斷裂的相關(guān)性比較好。DISCOVER-seq便是通過MRE11的CHIP-seq（染色質(zhì)免疫共沉淀）來反映CRISPR的脫靶位點。。。。上海育種脫靶檢測guide-sequence