CRISPR基于sgRNA與基因組序列互補(bǔ)定位到靶位點(diǎn)，不論哪種CRISPR系統(tǒng)，都存在sgRNA序列不完全匹配但能夠結(jié)合基因組的脫靶現(xiàn)象，CRISPR定位到脫靶位點(diǎn)引發(fā)序列改變就屬于第二類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)。CRISPR技術(shù)誕生剛過(guò)10年，期間迅速取代TALEN和ZFN，成為學(xué)術(shù)界通用的基因編輯技術(shù)，也徹底改變了我們的生物學(xué)研究方法。為提高CRISPR技術(shù)的安全性，特別是往臨床應(yīng)用發(fā)展時(shí)的安全性問(wèn)題，研究者們一直以提高靶位點(diǎn)的編輯效率和準(zhǔn)確性，同時(shí)降低脫靶位點(diǎn)編輯發(fā)生概率為目標(biāo)，來(lái)優(yōu)化CRISPR技術(shù)。另一方面，研究者們也開(kāi)發(fā)了大量檢測(cè)方法，用于檢測(cè)CRISPR的靶向風(fēng)險(xiǎn)和脫靶風(fēng)險(xiǎn)，用于早期sgRNA序列的篩選，以期望獲得一個(gè)較為安全的sgRNA。預(yù)算允許的情況下，通過(guò)全基因組測(cè)序的方法進(jìn)行全基因組序列的分析和比對(duì)更精細(xì)，如基于NGS的iGUIDE方法。溫州種子基因脫靶檢測(cè)評(píng)估

CIRCLE-seq原理。細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)方法由于提純的基因組已經(jīng)消化去除了組蛋白，結(jié)構(gòu)較細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)更為松散，理論上容易找到更多的脫靶位點(diǎn)。為捕獲CRISPR在細(xì)胞內(nèi)工作時(shí)真實(shí)發(fā)生的脫靶切割，研究者們也設(shè)計(jì)了一些細(xì)胞內(nèi)的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法。1) Guide-seqCRISPR造成DNA雙鏈斷裂后，由于DNA修復(fù)機(jī)制的存在，斷裂處很快就會(huì)重新連接，這時(shí)候提純基因組DNA很難保留CRISPR造成的DNA斷裂位點(diǎn)。所以為了記錄細(xì)胞內(nèi)真實(shí)的CRISPR脫靶切割，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了Guide-seq[10]，利用NHEJ的DNA修復(fù)機(jī)制，將一段雙鏈短核苷酸序列（dsODN）連接到CRISPR造成的DNA雙鏈斷裂處，相當(dāng)于連接了一輪接頭，然后再正常打斷基因組，在另一側(cè)連接第二輪接頭。通過(guò)這種方式構(gòu)建的文庫(kù)，就可以獲取脫靶位點(diǎn)一側(cè)的序列。雖然每次CRIPSR導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂并不一定都會(huì)連接dsODN，但反過(guò)來(lái)說(shuō)，越容易連接dsODN的位點(diǎn)，其發(fā)生脫靶切割的概率越高。通過(guò)Guide-seq找到的脫靶位點(diǎn)偏少，但一般都是可信度較高的脫靶位點(diǎn)，Guide-seq也是目前比較公認(rèn)的一種脫靶檢測(cè)方法。連云港育種脫靶檢測(cè)企業(yè)脫靶檢測(cè)評(píng)估，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

gRNA的長(zhǎng)度和錯(cuò)配： 17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長(zhǎng)度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類(lèi)細(xì)胞中減少潛在脫靶效應(yīng)的指導(dǎo)方針：1) 應(yīng)避免在PAM的7-10 bp范圍內(nèi)靶序列有超過(guò)3個(gè)錯(cuò)配；2) 在PAM的12 bp內(nèi)，應(yīng)避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應(yīng)。gRNA的化學(xué)修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦酰基乙酸酯會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時(shí)保持靶向性能。gRNA上游5'發(fā)夾結(jié)構(gòu)的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應(yīng)。

自基因zhiliao出現(xiàn)之日起，安全性問(wèn)題就隨之產(chǎn)生了，并成為阻礙基因zhiliao研發(fā)的一大障礙，吳寧博士認(rèn)為：“基因zhiliao產(chǎn)品的研發(fā)和上市，安全性會(huì)將是一個(gè)非常重要考量。如果一款產(chǎn)品它安全性有問(wèn)題的話，在市場(chǎng)化道路上就會(huì)受到很大影響。尤其是基因zhiliao，目前處于起始階段，一旦出現(xiàn)不良事件，很有可能對(duì)整個(gè)行業(yè)都會(huì)產(chǎn)生致命打擊。具體說(shuō)來(lái)，基因zhiliao的安全性問(wèn)題主要涉及基因插入突變、脫靶、生物分布和持久性、潛伏再jihuo以及潛在免疫原性等?！泵摪星懈钗稽c(diǎn)已在基因編輯技術(shù),CRISPR / Cas9,ZFNs和TALEN。

但是由于CHIP-seq實(shí)驗(yàn)本身的難度較高，DISCOVER-seq這類(lèi)方法的接受度并不高。3. 其他特殊方法CRISPR技術(shù)經(jīng)過(guò)這么多年的發(fā)展，其應(yīng)用已經(jīng)不局限于造成DNA雙鏈斷裂，一些不要切割DNA雙鏈的CRISPR衍生技術(shù)（如堿基編輯、先導(dǎo)編輯和CRISPRi/a），可以在不引發(fā)隨機(jī)突變的情況下，對(duì)基因組進(jìn)行精細(xì)編輯或者調(diào)控。這些技術(shù)所使用nCas9或dCas9只結(jié)合或者切割雙鏈中的一條鏈，之前的脫靶檢測(cè)方法都不能直接適用。這些CRISPR衍生技術(shù)中，CRISPR產(chǎn)生的脫靶可以被細(xì)分為兩個(gè)部分，其一是Cas9/sgRNA結(jié)合DNA導(dǎo)致的脫靶，這部分信息使用同樣序列的sgRNA進(jìn)行野生型Cas9脫靶位點(diǎn)檢測(cè)能夠間接得到內(nèi)基因編輯技術(shù)可能造成的脫靶效應(yīng),建立了一種被命名為GOTI。深圳種子基因脫靶檢測(cè)政策

內(nèi)基因編輯技術(shù)可能造成的脫靶效應(yīng)。溫州種子基因脫靶檢測(cè)評(píng)估

通常不需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的遺傳毒性組合試驗(yàn)，但應(yīng)根據(jù)基因zhiliao產(chǎn)品的特點(diǎn)、產(chǎn)品的具體適應(yīng)癥、載體的已有信息、導(dǎo)入基因序列結(jié)構(gòu)等，評(píng)估基因zhiliao產(chǎn)品整合進(jìn)基因組的可能性，判斷是否需要開(kāi)展另外的遺傳毒性研究，如研究基因組修飾的發(fā)生情況，并檢測(cè)隨后可能發(fā)生的異常細(xì)胞行為；評(píng)估插入突變（插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)等）引起的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品采用基因編輯或轉(zhuǎn)座子技術(shù)時(shí)，需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問(wèn)題；鑒定/表征基因組整合位點(diǎn)。溫州種子基因脫靶檢測(cè)評(píng)估