基因重排或重組。當基因zhiliao產(chǎn)品所用載體及其攜帶的基因發(fā)生復(fù)制時，可能出現(xiàn)非zhiliao目的非預(yù)期的基因表達或改變，或者與相應(yīng)野生型或輔助病毒互補后產(chǎn)生回復(fù)突變或意外復(fù)制或形成6新的病毒。免疫原性。由于基因zhiliao產(chǎn)品在體內(nèi)的持續(xù)暴露或者需要多次給藥等情況，機體可能產(chǎn)生針對基因zhiliao載體或編碼的作用因子的免疫應(yīng)答。由于基因zhiliao產(chǎn)品在靶細胞或組織中的表達時間、分布范圍或表達強度等差異，機體免疫應(yīng)答的后果可能從不具有臨床意義的一過性的免疫反應(yīng)，到針對靶細胞或組織的免疫攻擊，甚至產(chǎn)生嚴重危及生命的不良事件。種子基因脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準確率高。南京脫靶檢測報告

圍繞大家關(guān)心的CRISPR基因編輯安全性問題，我們首先對CRISPR脫靶位點檢測技術(shù)進行一次大盤點，在sgRNA設(shè)計階段需要如何做才能夠盡可能地避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。較簡單的脫靶位點檢測方法是全基因組測序（WGS），但在實際使用中，即使測序深度達到100X，也很難發(fā)現(xiàn)一些低頻率的脫靶位點，同時測序成本卻非常高。為彌補WGS的這些缺陷，常見的脫靶位點檢測技術(shù)都需要對脫靶位點進行捕獲富集，來提高檢測靈敏度，降低測序成本。按照實驗原理的不同，脫靶位點檢測技術(shù)可以分為細胞外、細胞內(nèi)和其他特殊方法這3類。江蘇crispr脫靶檢測安全性評價內(nèi)基因編輯技術(shù)可能造成的脫靶效應(yīng),建立了一種被命名為GOTI。

細胞外檢測方法：細胞外檢測方法較為直接，將基因組提純后進行CRISPR體外切割實驗，再捕獲發(fā)生脫靶切割的位點即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類細胞外脫靶位點檢測方法，提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后，再經(jīng)過標準的全基因組測序流程獲得測序數(shù)據(jù)，之后需要較為復(fù)雜的生物信息學分析才能夠獲得CRISPR切割位點的信息?？傮w來講，這種方法測序成本較高，并且檢測靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測到低頻脫靶位點，一般需要在建庫時定向捕獲CRISPR切割位點。SITE-seq就是這樣一種測序方法，提純的基因組DNA經(jīng)過Cas9/sgRNA切割后，在切割位點末端連接帶Biotin的接頭；再隨機打斷基因組，在另一端連接第二個接頭；經(jīng)過鏈霉親和素磁珠純化，只有一輪被Cas9切割的DNA才能夠被純化并測序，實現(xiàn)了CRISPR切割位點的富集。該方法雖然提高了脫靶位點的檢測靈敏度，但有著較高的實驗要求，每次需要投入大量的基因組DNA，并且無法區(qū)分提純基因組DNA時發(fā)生的隨機斷裂和Cas9的切割，導(dǎo)致產(chǎn)出較為明顯的背景信號。同時，由于一輪Biotin接頭只會接在Cas9切割位點的一側(cè)，導(dǎo)致測序結(jié)果里只能看到脫靶位點一側(cè)的序列。

長期隨訪的觀察時間長期隨訪的持續(xù)時間應(yīng)確保足以觀察到受試者因產(chǎn)品特性、暴露情況（生物分布和給藥途徑）等導(dǎo)致的風險，應(yīng)不短于遲發(fā)性不良反應(yīng)的預(yù)期發(fā)生時間。一般而言，針對不同類型的基因zhiliao產(chǎn)品建議如下：?具有基因組整合活性的載體（例如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體）和轉(zhuǎn)座子元件建議觀察不短于15年。?可以產(chǎn)生持續(xù)ganran、或有潛伏再jihuo風險的細菌或病毒載體（如單純皰疹病毒）建議觀察15年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風險（ganran或再jihuo）?；蚓庉嫯a(chǎn)品建議觀察15年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風險。?腺相關(guān)病毒載體建議觀察5年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風險。脫靶檢測guide-sequence，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準確率高。

BLESS：利用生物素標簽對DSBs進行原位標記，后經(jīng)PCR擴增實現(xiàn)對于生物素標記片段的富集，并通過二代測序?qū)崿F(xiàn)脫靶位點檢測。直接檢測細胞中的切割位點，靈敏度與細胞、組織密切相關(guān)。LAM-HTGTS，片段化的gDNA經(jīng)過LAM-PCR引入接頭，然后進行全基因組易位測序。高通量的全基因組范圍檢測，可準確檢測DSBs引發(fā)的重排。GUIDE-Seq，將dsODN    s標簽整合到DSBs位點，通過二代測序檢測這些標簽所在的基因組區(qū)域，從而確定脫靶突變的位置。廣使用的細胞內(nèi)檢測方法。能檢測低頻脫靶突變。Digenome-Seq，片段化的gDNA與CRISPR/RNP混合孵育，進行全基因組測序檢測脫靶。全基因組測序，直接檢測切割位點，能檢測低頻脫靶突變。高深度全基因組重測序服務(wù),該方法能多方位精細地對基因編輯的細胞或個體進行off-target檢測。蘇州種子脫靶檢測實驗室

高精度脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準確率高。南京脫靶檢測報告

插入突變風險評估一些整合性載體（如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、轉(zhuǎn)座子）可將外源基因插入整合到細胞基因組中，這可能會導(dǎo)致關(guān)鍵基因突變或jihuo原基因，從而導(dǎo)致惡性liu風險增加。影響插入突變的關(guān)鍵風險因素包括：（1）載體的整合特征，如插入位點的偏好性；（2）載體的設(shè)計，如增強子、啟動子等構(gòu)建元件的活性，影響鄰近基因的潛力；產(chǎn)生剪接突變體的潛在剪接位點或多聚腺苷酸信號等；（3）細胞載體拷貝數(shù)；4）轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的功能活性（如與細胞生長調(diào)控相關(guān)）和表達水平；5）靶細胞群的轉(zhuǎn)化可能性，這可能與細胞的分化狀態(tài)、增殖潛力、體外培養(yǎng)條件和體內(nèi)植入環(huán)境等有關(guān)。南京脫靶檢測報告