當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品在生殖qiguan持續(xù)存在時(shí)，需要進(jìn)一步研究確定其在生殖細(xì)胞（例如卵母細(xì)胞、精子）的暴露水平。根據(jù)載體類型、復(fù)制能力、基因組整合特性、劑量水平、給藥途徑等因素，分析評估基因zhiliao產(chǎn)品生殖系整合風(fēng)險(xiǎn)。遺傳毒性，基因zhiliao產(chǎn)品將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)或整合到宿主基因組中或?qū)λ拗骰蚪M進(jìn)行編輯，存在潛在的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。目前對于判斷細(xì)胞基因組插入/修飾是否會(huì)產(chǎn)生遺傳毒性、是否較終會(huì)發(fā)生變依然還缺乏系統(tǒng)的認(rèn)知，因此，需要分析基因組改變（載體或遺傳物質(zhì)整合進(jìn)基因組、對基因組編輯等）的特征，并評估相關(guān)潛在風(fēng)險(xiǎn)。選擇潛在的脫靶位點(diǎn)，例如選擇gRNA預(yù)測網(wǎng)站上Top 5潛在脫靶位點(diǎn)，進(jìn)行Sanger測序單克隆；嘉興基因編輯技術(shù)脫靶檢測技術(shù)

Guide-seq原理圖，Discover-seq細(xì)胞內(nèi)的脫靶切割一般無法直接捕獲，除了Guide-seq這種連接dsODN來間接記錄脫靶位點(diǎn)的方法外，研究者們還想出一種蛋白介導(dǎo)的方法Discover-seq。由于DNA雙鏈斷裂后細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制，大量蛋白參與到斷裂處的修復(fù)，所以研究者就對相關(guān)蛋白進(jìn)行篩選，找到其中MRE11結(jié)合DNA的位點(diǎn)與DNA雙鏈斷裂的相關(guān)性比較好。DISCOVER-seq便是通過MRE11的CHIP-seq（染色質(zhì)免疫共沉淀）來反映CRISPR的脫靶位點(diǎn)。。。。深圳種子基因脫靶檢測安評如何檢測是否發(fā)生脫靶？

R-loop seq雖然不是一種真正意義上的脫靶位點(diǎn)檢測方法，但能為堿基編輯脫氨酶的脫靶提供一種度量方法，以便于之后的脫氨酶點(diǎn)突變優(yōu)化，來降低脫靶的發(fā)生幾率。2) Detect-seqCRISPR衍生技術(shù)由于其復(fù)雜性，檢測其脫靶位點(diǎn)的hexin思路是捕獲實(shí)驗(yàn)過程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物或者終產(chǎn)物。這種設(shè)計(jì)思路下，目前較為成功的是檢測堿基編輯CBE脫靶位點(diǎn)的Detect-seq[13]。CBE的原理是將dC脫氨變?yōu)閐U，迫使其對側(cè)的dG變?yōu)閐A，較終將堿基對從C-G轉(zhuǎn)變?yōu)門-A。Detect-seq便是針對中間態(tài)的dU，使用Uracil DNA Glycosylase (UDG)，去除U堿基后，替換為帶Biotin的U堿基，捕獲堿基編輯的脫靶位點(diǎn)，并且sgRNA依賴和sgRNA不依賴的脫靶位點(diǎn)都能找到。該方法類似檢測DNA甲基化的重亞硫酸鹽測序法，通過處理特定的堿基，可以捕獲全基因組上的CBE脫靶位點(diǎn)。

對于基因修飾細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品，充分的非臨床研究是為了：（1）闡明基因修飾的目的、功能以及產(chǎn)品的作用機(jī)制，明確其在擬定患者人群中使用的生物學(xué)合理性；（2）為臨床試驗(yàn)的給藥途徑、給藥程序、給藥劑量的選擇提供支持性依據(jù)；（3）根據(jù)潛在風(fēng)險(xiǎn)因素，闡明毒性反應(yīng)特征，預(yù)測人體可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，確定不良反應(yīng)的臨床監(jiān)測指標(biāo)，為制定臨床風(fēng)險(xiǎn)控制措施提供參考依據(jù)。因此，應(yīng)充分開展非臨床研究，收集用于風(fēng)險(xiǎn)獲益評估的信息，以確立擬開發(fā)產(chǎn)品在目標(biāo)患者人群中預(yù)期具有合理的、可接受的獲益風(fēng)險(xiǎn)比，同時(shí)為臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和風(fēng)險(xiǎn)控制策略的制定提供支持性依據(jù)。高深度全基因組重測序服務(wù),該方法能多方位精細(xì)地對基因編輯的細(xì)胞或個(gè)體進(jìn)行off-target檢測。

采用基因編輯技術(shù)制備的細(xì)胞產(chǎn)品。對于采用基因編輯技術(shù)制備的基因修飾細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)進(jìn)行體外在靶和脫靶活性評估，以確認(rèn)修飾酶或向?qū)NA對靶基因序列的特異性。在評估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)說明所選擇的評價(jià)策略的合理性和敏感性。雖然采用計(jì)算機(jī)分析預(yù)測基因編輯的潛在脫靶位點(diǎn)，并對潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行深度測序分析，可用于評估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn)；但選擇的評價(jià)策略仍應(yīng)包含體外全基因組測序比對，以證明潛在脫靶位點(diǎn)未出現(xiàn)脫靶。此外，在評估脫靶活性時(shí)，還應(yīng)評估種屬特異性的差異、細(xì)胞病理生理狀態(tài)的差異或細(xì)胞類型的差異對非臨床數(shù)據(jù)預(yù)測性的影響。必要時(shí)，還應(yīng)分析基因編輯對細(xì)胞表型和生理功能的潛在影響。值得收藏的CRISPR脫靶檢測方法。北京crispr/cas9脫靶檢測安全性評價(jià)

基因編輯脫靶將無處隱藏。嘉興基因編輯技術(shù)脫靶檢測技術(shù)

CIRCLE-seq和CHANGE-seq與SITE-seq同期發(fā)表的CIRCLE-seq一定程度上解決了SITE-seq的一些問題。CIRCLE-seq的第一步是將純化后的基因組DNA隨機(jī)打斷成300bp左右的片段，然后首尾相連成環(huán)狀DNA，這種方法很好地避免了DNA隨機(jī)斷裂造成的背景噪聲。實(shí)驗(yàn)的第二步是用Cas9切割環(huán)狀DNA，再連上接頭并進(jìn)行雙端測序，這樣就可以在一次測序中同時(shí)獲取切割位點(diǎn)的兩側(cè)序列，彌補(bǔ)了SITE-seq的另一個(gè)缺點(diǎn)。CIRCLE-seq從總體上來說要優(yōu)于SITE-seq，但是將基因組DNA隨機(jī)打斷后成環(huán)的效率并不高，所以同一作者在3年后發(fā)表了CHANGE-seq，用Tn5一步法打斷基因組并加接頭，提高了成環(huán)效率，降低了起始基因組DNA的用量。嘉興基因編輯技術(shù)脫靶檢測技術(shù)