CRISPR基于sgRNA與基因組序列互補(bǔ)定位到靶位點，不論哪種CRISPR系統(tǒng)，都存在sgRNA序列不完全匹配但能夠結(jié)合基因組的脫靶現(xiàn)象，CRISPR定位到脫靶位點引發(fā)序列改變就屬于第二類風(fēng)險。CRISPR技術(shù)誕生剛過10年，期間迅速取代TALEN和ZFN，成為學(xué)術(shù)界通用的基因編輯技術(shù)，也徹底改變了我們的生物學(xué)研究方法。為提高CRISPR技術(shù)的安全性，特別是往臨床應(yīng)用發(fā)展時的安全性問題，研究者們一直以提高靶位點的編輯效率和準(zhǔn)確性，同時降低脫靶位點編輯發(fā)生概率為目標(biāo)，來優(yōu)化CRISPR技術(shù)。另一方面，研究者們也開發(fā)了大量檢測方法，用于檢測CRISPR的靶向風(fēng)險和脫靶風(fēng)險，用于早期sgRNA序列的篩選，以期望獲得一個較為安全的sgRNA。針對已經(jīng)獲得的有切割能力的sgRNA，需要進(jìn)一步明確其體內(nèi)脫靶效應(yīng)。臺州off-target脫靶檢測安全性評價

GUIDE-Seq脫靶評估技術(shù)的優(yōu)勢分析鼓潤致力于基因組編輯工具脫靶的分析檢測工作，為篩選、優(yōu)化基因組編輯工具的保真性提供標(biāo)準(zhǔn)化的分析。我們脫靶分析具有如下優(yōu)勢：實用性強(qiáng)：能反映CRISPR在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯的在靶與脫靶情況，以進(jìn)行安全性和有效性評價；檢測通量高：一次能檢測多個樣本的在靶與脫靶情況，并通過優(yōu)化的標(biāo)簽設(shè)計，降低實際的測序reads數(shù)量；準(zhǔn)確性高：絕大部分檢測結(jié)果可被驗證；靈敏度高：能夠高效檢測出低頻脫靶位點，檢測低至0.1%的脫靶突變；實驗難度低：操作過程簡單易行細(xì)胞適應(yīng)性強(qiáng)。浙江育種脫靶檢測評估隨著脫靶影響因素、降低策略及脫靶檢測技術(shù)研究的不斷深入，未來CRISPR/Cas9系統(tǒng)將在更多領(lǐng)域造福人類。

臨床研究人群，如果一種基因zhiliao產(chǎn)品具有引起遲發(fā)性不良反應(yīng)的風(fēng)險，需要開展長期隨訪觀察時，所有接受基因zhiliao產(chǎn)品的受試者在簽署知情同意書后均應(yīng)入組長期隨訪臨床研究。在設(shè)計長期隨訪臨床研究的方案時，應(yīng)考慮目標(biāo)受試者人群及特征、整體健康情況以及接受zhiliao的患者的預(yù)期生存期等特征對遲發(fā)性不良反應(yīng)的收集的影響。通常來說，當(dāng)臨床研究人群的某些特征（如預(yù)期壽命短、多重合并癥、以及暴露于放療或化療等其他藥物）可能干擾遲發(fā)性不良反應(yīng)的觀察分析時，會影響長期隨訪觀察在評估和減輕受試者風(fēng)險方面的效用；而在病情較輕或較局限，合并癥以及伴隨zhiliao有限或較穩(wěn)定的受試者中，通過長期隨訪觀察收集到的評估數(shù)據(jù)可能更容易分析。

CIRCLE-seq原理。細(xì)胞內(nèi)檢測方法由于提純的基因組已經(jīng)消化去除了組蛋白，結(jié)構(gòu)較細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)更為松散，理論上容易找到更多的脫靶位點。為捕獲CRISPR在細(xì)胞內(nèi)工作時真實發(fā)生的脫靶切割，研究者們也設(shè)計了一些細(xì)胞內(nèi)的脫靶位點檢測方法。1) Guide-seqCRISPR造成DNA雙鏈斷裂后，由于DNA修復(fù)機(jī)制的存在，斷裂處很快就會重新連接，這時候提純基因組DNA很難保留CRISPR造成的DNA斷裂位點。所以為了記錄細(xì)胞內(nèi)真實的CRISPR脫靶切割，研究者們設(shè)計了Guide-seq[10]，利用NHEJ的DNA修復(fù)機(jī)制，將一段雙鏈短核苷酸序列（dsODN）連接到CRISPR造成的DNA雙鏈斷裂處，相當(dāng)于連接了一輪接頭，然后再正常打斷基因組，在另一側(cè)連接第二輪接頭。通過這種方式構(gòu)建的文庫，就可以獲取脫靶位點一側(cè)的序列。雖然每次CRIPSR導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂并不一定都會連接dsODN，但反過來說，越容易連接dsODN的位點，其發(fā)生脫靶切割的概率越高。通過Guide-seq找到的脫靶位點偏少，但一般都是可信度較高的脫靶位點，Guide-seq也是目前比較公認(rèn)的一種脫靶檢測方法。脫靶檢測分析，推薦唯可生物，實驗實力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

細(xì)胞經(jīng)基因修飾后會改變其生物學(xué)特性，同時也會帶來新的安全性風(fēng)險，如基因編輯脫靶風(fēng)險、載體插入突變風(fēng)險、載體重組風(fēng)險、表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的風(fēng)險等。在制定非臨床研究計劃時，除參考《細(xì)胞zhilliao產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）中的對細(xì)胞zhilliao產(chǎn)品的一般要求外，還應(yīng)具體問題具體分析，基于產(chǎn)品特點和目前已有的科學(xué)認(rèn)知，結(jié)合擬定適應(yīng)癥、患者人群、給藥途徑和給yaofang案等方面的考慮，科學(xué)合理的設(shè)計和實施非臨床研究，充分表征產(chǎn)品的藥理學(xué)、毒理學(xué)和藥代動力學(xué)特征。在進(jìn)行獲益風(fēng)險評估時，還應(yīng)重點關(guān)注由非臨床向臨床過渡時非臨床研究的局限性和風(fēng)險預(yù)測的不確定性。脫靶檢測在揭示CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶機(jī)制以及進(jìn)一步提高系統(tǒng)靶向性的研究中具有重要作用。常州crispr/cas9脫靶檢測guide-sequence

如何降低脫靶效應(yīng)？選擇特異的gRNA； 使用RNP； 使用eSpCas9的質(zhì)粒； 使用Nickase Cas9。臺州off-target脫靶檢測安全性評價

先導(dǎo)編輯器：CBE和ABE組合使用可以有效地進(jìn)行4種堿基轉(zhuǎn)換（C→T, G→A, A→G, T→C），而無需產(chǎn)生DSB，然而除了這4種堿基轉(zhuǎn)換，對另外8種堿基轉(zhuǎn)換（C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G）以及堿基的插入和缺失，依然缺乏有效的研究工具。先導(dǎo)編輯器（Prime Editor, PE），PE在不依賴DSB和供體DNA的條件下便可有效實現(xiàn)所有12種堿基轉(zhuǎn)換，此外還能有效實現(xiàn)多堿基的精細(xì)插入（較多可插入44bp）和刪除（較多刪除80bp）。> 抗CRISPR蛋白?？笴RISPR（Acr）蛋白是天然的CRISPR/Cas系統(tǒng)抑制劑，由各種可移動遺傳元件（MGEs）編碼，在不同階段抑制CRISPR-Cas的免疫功能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多達(dá)45個Acr蛋白，其中 "AcrIIA4 "有可能保護(hù)細(xì)胞免受編輯。Shin和他的同事發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)整AcrIIA4或Cas9加入實驗的時間，AcrIIA4將脫靶修飾減少了4倍，而沒有減少靶向效應(yīng)。臺州off-target脫靶檢測安全性評價