多光子顯微鏡通過引入具有超高透射率、非常陡峭的邊緣和精心優(yōu)化的阻擋的濾光片，為多光子用戶帶來了增強的性能。考慮到激發(fā)激光器和多光子成像系統(tǒng)的其他復(fù)雜元件通常需要多少投資，這些新的光學(xué)濾光片**了一種簡單且廉價的升級，可以顯著提高系統(tǒng)性能。事實上，與傳統(tǒng)濾光片的褐**調(diào)相比，發(fā)射濾光片看起來像窗戶玻璃一樣清晰，而且LWP二向色鏡具有如此寬的反射帶，它們看起來像高反射鏡。發(fā)射濾光片還在Ti:Sapphire激光調(diào)諧范圍內(nèi)提供深度阻擋，這對于實現(xiàn)高信噪比和測量靈敏度至關(guān)重要。利用多光子顯微鏡的多點光ji活能力，我們可以研究多個神經(jīng)細胞之間的連接和控制。布魯克多光子顯微鏡準確定位

對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué)，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。共聚焦多光子顯微鏡研究由于其非侵入性和高分辨率的特點，多光子顯微鏡在神經(jīng)科學(xué)、ai癥研究、免疫學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學(xué)標記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1-1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者相比，雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學(xué)成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像。例如，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達的實時在體成像。

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個優(yōu)勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認識。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題，但這會帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。多光子顯微鏡是一種強大的顯微鏡技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

多光子成像系統(tǒng)提供的優(yōu)勢包括了真正的三維成像、對活組織內(nèi)部深處進行成像的能力以及消除平面外熒光的能力。使用這種方法進行成像，可以對斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的熒光染料進行成像，甚至可以對樣品或組織中固有的熒光分子進行成像。多光子成像的缺點包括需要高峰值功率脈沖激光器，例如鎖模鈦：藍寶石激光器，并且直到現(xiàn)在，缺乏在整個發(fā)射范圍內(nèi)提供足夠吞吐量的高性能濾光片。整個激光調(diào)諧范圍內(nèi)的興趣和足夠的阻擋。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。共聚焦多光子顯微鏡研究

高精度、低損傷、高速掃描，多光子顯微鏡為科研工作提供強大支持。布魯克多光子顯微鏡準確定位

2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦，會聚角為Δθ。光束進入到一對幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S，偏角為α。經(jīng)過反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α），脈沖間以2S/c的時間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。布魯克多光子顯微鏡準確定位