WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺較左邊。從雙光子到三光子科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細胞進行實驗，還有一些短波長可以利用雙光子特性進行特定實驗。國內雙光子顯微鏡光子躍遷

微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結構的方式，可用于在動物覓食、哺乳、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，長時程觀察神經突觸、神經元、神經網絡、遠程連接的腦區(qū)等多尺度、多層次動態(tài)變化。該成果在2016年底美國神經科學年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學專題會議上報告后，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內的國內外神經科學家的高度贊譽。冷泉港亞洲腦科學專題會議、美國明顯神經科學家加州大學洛杉磯分校的AlcinoJSilva教授在評述中寫道，“從任何一個標準來看，這款顯微鏡都了一項重大技術發(fā)明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結構的方式。它所開啟的大門，甚至超越了神經元和樹突成像。系統(tǒng)神經生物學正在進入一個新的時代，即通過對細胞群體中可辨識的細胞和亞細胞結構的復雜生物學事件進行成像觀測。進口激光熒光雙光子顯微鏡作用雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應用；

要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造。關于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細胞，使掃描能更好地進行。

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學散射。

配合雙光子激發(fā)技術，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產生熒光，該點產生的熒光再次穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡是結合了雙光子技術和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。布魯克雙光子顯微鏡成像技術

雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中；國內雙光子顯微鏡光子躍遷

雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術，能夠實現(xiàn)細胞或組織的深層觀察。它的主要特點是使用雙光子激發(fā)來產生熒光，從而實現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性，將高能激光束聚焦到生物樣品中，激發(fā)出熒光。這個過程需要使用一個特殊的雙光子激發(fā)源，它能夠將一個光子轉換為兩個光子，其中一個光子用于激發(fā)熒光，另一個光子則用于成像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點：高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性，可以實現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像，特別是對于深層組織的觀察。穿透深度大：雙光子激光的波長較長，能夠更好地穿透生物組織，從而實現(xiàn)對深層細胞的觀察。熒光壽命長：雙光子激發(fā)產生的熒光壽命比單光子激發(fā)產生的熒光壽命長，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標記物。減少光毒性：由于雙光子激發(fā)的能量較低，因此對生物樣品的損傷較小，可以減少光毒性?？傊p光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術，可以用于生物學、醫(yī)學、材料科學等領域的研究。國內雙光子顯微鏡光子躍遷