雙光子顯微鏡是一種先進(jìn)的成像技術(shù),能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞或組織的深層觀察。它的主要特點(diǎn)是使用雙光子激發(fā)來產(chǎn)生熒光,從而實(shí)現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性,將高能激光束聚焦到生物樣品中,激發(fā)出熒光。這個(gè)過程需要使用一個(gè)特殊的雙光子激發(fā)源,它能夠?qū)⒁粋€(gè)光子轉(zhuǎn)換為兩個(gè)光子,其中一個(gè)光子用于激發(fā)熒光,另一個(gè)光子則用于成像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點(diǎn):高分辨率:由于雙光子激發(fā)的特性,可以實(shí)現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像,特別是對于深層組織的觀察。穿透深度大:雙光子激光的波長較長,能夠更好地穿透生物組織,從而實(shí)現(xiàn)對深層細(xì)胞的觀察。熒光壽命長:雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命比單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命長,這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標(biāo)記物。減少光毒性:由于雙光子激發(fā)的能量較低,因此對生物樣品的損傷較小,可以減少光毒性??傊?,雙光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術(shù),可以用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡,其原理大致是這樣的;國內(nèi)熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么
為了驗(yàn)證動物生物樣品的時(shí)間分辨成像能力,本實(shí)驗(yàn)觀察了活海拉細(xì)胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1,見圖3(a),(c)-(i)。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致,對比可見v2PE在空間分辨率、激發(fā)深度級圖像對比度較常規(guī)寬場顯微鏡都有所提高。此外,v2PE可以同時(shí)激發(fā)多個(gè)波長的熒光蛋白,這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子的三維動力學(xué)多色成像。在此基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)對海拉細(xì)胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進(jìn)行了在體成像,見圖3(j)-(n),青色為mTFP1,綠色為EGFP,實(shí)驗(yàn)中兩種熒光蛋白同時(shí)成像,終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號分離出來。美國激光熒光雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)雙光子顯微鏡使用方法是什么?
從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):☆穿透能力強(qiáng):相對于紫外光,可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,因而受生物組織散射的影響更小,解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題;☆高分辨率:由于雙光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi);☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處,所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象;☆熒光收集率高:與共聚焦成像相比,雙光子成像不需要光學(xué)濾波器(共焦),這樣就提高了對熒光的收集率,而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高。
雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),早在20多年前就有了,目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子過期后,已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上。即便如此,世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子,自己搭的好處有很多,首先是便宜,尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器,那就更很省錢了。其次是靈活,可以選擇針對特殊用途的搭配,改動也靈活。好處就是可以鍛煉隊(duì)伍,一趟走下來可以把新手帶出來,后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少,首先是操心,特別是第1次搭的時(shí)候,開始要想方案,后來要解決各種實(shí)際問題。其次是花時(shí)間,加上買配件的時(shí)間,比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長?,F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,各種protocol,大多是老外寫的,中文的較少。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,尤其是沒有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候,容易走彎路,多花錢,也多花時(shí)間,再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,在國內(nèi)買這些東西耗時(shí)較長。因此,我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn),貼出來分享,希望能幫到想自己動手的實(shí)驗(yàn)室,雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被發(fā)動,所以雙光子成像更清晰。
雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子,在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子;其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙(多)光子成像優(yōu)勢在于,具有更深的組織穿透深度,利用紅外光,能夠在層面檢測極限達(dá)1mm的組織區(qū)域;因信號背景比高,而具有更高的對比度;因激發(fā)體積小,具有定點(diǎn)激發(fā)的特性,具有更少的光毒性;激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),能夠更加安全。微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢是。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡的原理
雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。國內(nèi)熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么
雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?生物組織在近紅外波段存在兩個(gè)窗口,第1個(gè)近紅外窗口對應(yīng)波長在700nm-900nm,第2個(gè)近紅外窗口對應(yīng)波長在1000nm-1400nm之間。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的,但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點(diǎn):1.生物組織對紅外光的吸收弱,對可見光吸收強(qiáng)。類似的,平時(shí)用手電筒照射手指,會看到手通透紅亮,也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長λ的四次方。類似的,早晨的太陽非常紅,也就是因?yàn)殚L波長的紅光穿透力更強(qiáng)。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強(qiáng)。國內(nèi)熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么