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國內(nèi)激光雙光子顯微鏡分辨率是多少

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-11-12

雙光子顯微鏡的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子,在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子;其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,為了不損傷細(xì)胞,雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖寬度只有100飛秒,而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí),物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,提高了熒光檢測效率。于雙光子激發(fā)需要兩個(gè)光子同時(shí)到達(dá),因此只有在焦點(diǎn)附近的樣品區(qū)域才會(huì)激發(fā),從而實(shí)現(xiàn)三維成像和高分辨率。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡分辨率是多少

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隨著技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,結(jié)合它的特點(diǎn),大致可以分成深和活兩方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,大致可從兩個(gè)方面入手,裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,我們可以把激光束變得更細(xì),使能量更加集中,就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,解決這個(gè)問題,我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,讓標(biāo)本“透明度”提高。美國ultima雙光子顯微鏡商家雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。

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雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,其原理大致是這樣的:首先,讓我們來看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源,照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料,使其發(fā)出熒光。相比普通光學(xué)顯微鏡,熒光顯微鏡運(yùn)用了波長更短的紫外線,再將可見光過濾掉,提高了分辨力率。而當(dāng)被檢物體過厚時(shí),從不同深度發(fā)出的熒光都會(huì)打在物鏡上,使觀察到的像模糊、發(fā)虛,無法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu)。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上,增加了激光掃描裝置,從而解決了上述問題。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束經(jīng)照明孔,經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,并聚焦于樣品上,對標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡,通過探測孔時(shí)先聚焦,然后被光探頭收集,轉(zhuǎn)化為信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。這個(gè)裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光,使成像更為清晰準(zhǔn)確,同時(shí)通過改變物鏡的焦距,能對不同焦平面進(jìn)行掃描,通過計(jì)算機(jī)繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像。

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號(hào),這是揭示動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡(2PM)可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,從而測量不透明大腦深處的活動(dòng);成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng),目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實(shí)現(xiàn),但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像,需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,虛擬源越遠(yuǎn),物鏡處的光束尺寸越大,焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。

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隨著技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,結(jié)合它的特點(diǎn),大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,大致可從兩個(gè)方面入手,裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,我們可以把激光束變得更細(xì),使能量更加集中,就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,解決這個(gè)問題,我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,讓標(biāo)本的“透明度”得到提高。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。進(jìn)口激光雙光子顯微鏡用途

雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡分辨率是多少

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),早在20多年前就有了,目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子**過期后,已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上。即便如此,世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子,自己搭的好處有很多,首先是便宜,尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器,那就更很省錢了。其次是靈活,可以選擇針對特殊用途的搭配,改動(dòng)也靈活。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊(duì)伍,一趟走下來可以把新手帶出來,后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少,首先是操心,特別是第1次搭的時(shí)候,開始要想方案,后來要解決各種實(shí)際問題。其次是花時(shí)間,加上買配件的時(shí)間,比買一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長。現(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,各種protocol,大多是老外寫的,中文的較少。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,尤其是沒有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候,容易走彎路,多花錢,也多花時(shí)間,再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,在國內(nèi)買這些東西耗時(shí)較長。因此,我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn),貼出來分享,希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室國內(nèi)激光雙光子顯微鏡分辨率是多少