細胞在受到外界刺激時，隨著刺激時間的增長，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號不但不會繼續(xù)增強，反而會減弱，直至恢復到未加刺激物時的水平。對于細胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時，Ca2+熒光信號強度卻會出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對研究受精發(fā)育的早期信號及Ca2+在卵細胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細胞分裂、胞吐作用等，Ca2+熒光信號強度也會發(fā)生很強的變化。多光子顯微鏡的發(fā)展歷史充滿了貢獻、開發(fā)、進步和數(shù)個世紀以來多個來源和地點的改進。嚙齒類多光子顯微鏡成像區(qū)域

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式，使用振鏡進行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結合在一起進行快速3D掃描，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描。該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)需要依賴于遠程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡。嚙齒類多光子顯微鏡成像區(qū)域光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學和材料科學中廣泛應用。

單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光，是從熒光產(chǎn)生的機理上來區(qū)分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結構，其目的是為了，通過共焦結構，提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同，實現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結構）其空間分辨率也可以達到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡化整個系統(tǒng)，相對來說，就提高了激發(fā)光源的利用率，以及熒光的探測效率，這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應和共焦結構，分辨率則會更高，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的。

多束掃描技術可以同時對神經(jīng)元組織的不同位置進行成像。該技術:對于兩個遠程成像位置(相距1-2mm以上)，通常采用兩個**的路徑進行成像；對于相鄰區(qū)域，通常使用單個物鏡的多個光束進行成像。多光束掃描技術必須特別注意激發(fā)光束之間的串擾，這可以通過事后光源分離或時空復用來解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串擾的算法；時空復用法是指同時使用多個激發(fā)光束，每個光束的脈沖在時間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個熒光信號可以暫時分離。引入的光束越多，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會導致熒光衰減時間重疊增加，從而限制了分辨信號源的能力；并且復用對電子設備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比，這樣容易導致組織損傷。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等。

雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點∶a.光損傷小∶雙光子熒光顯微鏡使用可見光或近紅外光作為激發(fā)光，對細胞和組織的光損傷很小，適合于長時間的研究;b.穿透能力強∶相對于紫外光，可見光或近紅外光具有很強的穿透性，可以對生物樣品進行深層次的研究;c．高分辨率∶由于雙光子吸收截面很小P，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為λ范圍內(nèi);d.漂白區(qū)域很小，焦點以外不發(fā)生漂白現(xiàn)象。e．熒光收集率高。與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學濾波器，提高了熒光收集率。收集效率提高直接導致圖像對比度提高。f.對探測光路的要求低。由于激發(fā)光與發(fā)射熒光的波長差值加大以及自發(fā)的三維濾波效果，多光子顯微鏡對光路收集系統(tǒng)的要求比單光子共焦顯微鏡低得多，光學系統(tǒng)相對簡單。g.適合多標記復合測量。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜要比單光子激發(fā)譜寬闊，這樣，可以利用單一波長的激發(fā)光同時激發(fā)多種染料，從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息，便于相互對照、補充。多光子顯微鏡適用于動物大腦皮層深層（400微米）細胞的形態(tài)、生理學研究。布魯克多光子顯微鏡暗場成像

未來國產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。嚙齒類多光子顯微鏡成像區(qū)域

多光子成像系統(tǒng)提供的優(yōu)勢包括了真正的三維成像、對活組織內(nèi)部深處進行成像的能力以及消除平面外熒光的能力。使用這種方法進行成像，可以對斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的熒光染料進行成像，甚至可以對樣品或組織中固有的熒光分子進行成像。多光子成像的缺點包括需要高峰值功率脈沖激光器，例如鎖模鈦：藍寶石激光器，并且直到現(xiàn)在，缺乏在整個發(fā)射范圍內(nèi)提供足夠吞吐量的高性能濾光片。整個激光調(diào)諧范圍內(nèi)的興趣和足夠的阻擋。嚙齒類多光子顯微鏡成像區(qū)域