與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)[1]。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來(lái)，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過(guò)增加激光強(qiáng)度來(lái)解決散射問(wèn)題，但這會(huì)帶來(lái)其他問(wèn)題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光。光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。美國(guó)全自動(dòng)多光子顯微鏡設(shè)備

通過(guò)添加FACED模塊，可以將基于標(biāo)準(zhǔn)振鏡的現(xiàn)有2PM輕松轉(zhuǎn)換為千赫茲成像系統(tǒng)。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描，需要很少的計(jì)算處理，在稀疏或密集的標(biāo)記樣本中均可以使用，并且不受串?dāng)_的影響，而且對(duì)整個(gè)圖像平面采樣后可以進(jìn)行運(yùn)動(dòng)校正。實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有觀察到光損傷的跡象，此外，子脈沖延遲到達(dá)相同的樣品位置，能為熒光團(tuán)提供充足的時(shí)間使其從易于破壞的暗態(tài)返回到基態(tài)，可以明顯減少光漂白。使用現(xiàn)有的傳感器，F(xiàn)ACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來(lái)檢測(cè)神經(jīng)元過(guò)程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變，以及來(lái)自細(xì)胞體的尖峰和亞閾值電壓。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡，在小鼠大腦中實(shí)現(xiàn)了千赫茲速率的神經(jīng)活動(dòng)成像。在物鏡平均激光功率為10-85mW下，他們測(cè)量了清醒小鼠中V1神經(jīng)元的自發(fā)性和感覺(jué)誘發(fā)性的超閾值和亞閾值電位活動(dòng)。美國(guó)高速高分辨率多光子顯微鏡多光子激光掃描顯微鏡是建立在激光掃描顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)方法，三維觀察上提供更的光學(xué)切片能力。

    基于多光子顯微鏡的神經(jīng)成像技術(shù)原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像，因此可用于拍攝不透明的厚樣品。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共焦類似，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長(zhǎng)比共焦長(zhǎng)，能量較低，但穿透能力較強(qiáng)；2)雙光子顯微鏡沒(méi)有小孔，提高了檢測(cè)效率；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)呢？原因是它采用雙光子激發(fā)方式。使用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的激發(fā)光子，光子的能量較低，因此電子需要吸收兩個(gè)這樣的激發(fā)光子才能達(dá)到激發(fā)態(tài)，從而釋放出一個(gè)熒光光子。因此，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的平方成正比。因?yàn)榻裹c(diǎn)處的光強(qiáng)較大，只能在焦點(diǎn)處激發(fā)熒光。波長(zhǎng)越長(zhǎng)，穿透力越強(qiáng)，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡。由于兩個(gè)光子只在焦點(diǎn)激發(fā)熒光，不需要小孔，而是將所有的熒光都收集起來(lái)，提高了檢測(cè)效率。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡，利用三個(gè)激發(fā)光子可以實(shí)現(xiàn)更深的成像深度。由于使用了更長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)，穿透能力更強(qiáng)，成像深度更大。此外，由于較強(qiáng)的非線性效應(yīng)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的立方成正比，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲。

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動(dòng)透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描，但可調(diào)電動(dòng)透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無(wú)法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過(guò)調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來(lái)擴(kuò)大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無(wú)法快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。多光子顯微鏡中，極短的激光脈沖聚焦在樣品上的緊密點(diǎn)上，激發(fā)熒光團(tuán)產(chǎn)生圖像。

多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國(guó)和日本，德國(guó)是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng) 64.44%的市場(chǎng)份額，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的走向。目前世界市場(chǎng)對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長(zhǎng)，中國(guó)市場(chǎng)這方面的需求增長(zhǎng)更快，未來(lái)五年多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的發(fā)展在中國(guó)將具有很大的發(fā)展?jié)摿?。多光子顯微鏡已經(jīng)被生物學(xué)家普遍的運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)中。布魯克多光子顯微鏡供應(yīng)商

多光子顯微鏡在臨床前評(píng)價(jià)IA形態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞密度和血管形成等方面顯示出強(qiáng)大的作用。美國(guó)全自動(dòng)多光子顯微鏡設(shè)備

多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足。只能對(duì)熒光成像。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團(tuán)，如色素，樣品可能受到熱損傷。分辨率略有降低，雖然可以通過(guò)同時(shí)利用共焦的小孔得到改善，但是信號(hào)會(huì)有損耗。受昂貴的超快激光器限制，多光子掃描顯微鏡的成本較高。多光子激發(fā)顯微鏡應(yīng)用舉例。動(dòng)物和腦片神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能、動(dòng)物腦皮層的成像、胚胎發(fā)育過(guò)程的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀測(cè)、多光子激發(fā)光解籠、細(xì)胞內(nèi)微區(qū)鈣動(dòng)力學(xué)、多光子激發(fā)自發(fā)熒光、其它應(yīng)用。美國(guó)全自動(dòng)多光子顯微鏡設(shè)備