培養(yǎng)至第12～20天收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)。結(jié)果討論在一個為期12天的試驗(yàn)中，志愿者1(do**)的pbmc在使用acd3-sh時可以擴(kuò)增(圖9a，空心圓圈)，而使用okt3時可以擴(kuò)增(圖9a，實(shí)心圓)。在對志愿者2(donor2)pbmc的19天擴(kuò)增試驗(yàn)中，分別是491倍和251倍(圖9b)。結(jié)果顯示，改造抗體acd3-sh具有更高的激發(fā)nkt細(xì)胞擴(kuò)增的活力。培養(yǎng)實(shí)例3nk細(xì)胞特異性擴(kuò)增和純度檢測本測試取志愿者提供的血樣，分離pbmc后平均分為2份，分別用改造獲得的改造抗體acd3-sh、acd16-sh和acd52-sh(試驗(yàn)組)和原型抗體okt3、acd16-3g8和campath-1h(對照組)進(jìn)行培養(yǎng)，并刺激人pbmc中nk細(xì)胞(cd3-cd16+cd56+)的增殖，通過對細(xì)胞成分分析來比較抗體組的功能。材料人靜脈血，基礎(chǔ)培養(yǎng)基x-vivo15(lonza，04-418q)，擴(kuò)增培養(yǎng)基(x-vivo15，il-21000iu/ml)，人血清(genimi，100-512)。細(xì)胞培養(yǎng)和檢測方法分離pbmc細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到1e6/ml。加入試驗(yàn)組或?qū)φ战M抗體、il-2(1000iu/ml)、人血清(5％)。在37℃、5％co2培養(yǎng)72小時。加入等體積的擴(kuò)增培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。之后每隔48小時取樣計(jì)數(shù)，用擴(kuò)增培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至第14天收獲細(xì)胞，用熒光抗體percpmouseanti-human-cd3(bdbiosciences。DMEM高糖培養(yǎng)基具有優(yōu)越的穩(wěn)定性。天津MEM細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口

    空心圓圈)，原型抗體okt3的ed50為130ng/ml(圖8，實(shí)心圓)，說明目標(biāo)細(xì)胞t細(xì)胞對acd3-sh更加敏感。同時，在飽和抗體濃度下，acd3-sh的**大擴(kuò)增信號也明顯強(qiáng)于okt3的。結(jié)果顯示，改造抗體acd3-sh明顯具有更高的激發(fā)t細(xì)胞擴(kuò)增的活力。培養(yǎng)實(shí)例2nkt細(xì)胞培養(yǎng)及抗人cd3抗體的擴(kuò)增活力檢測本測試分別用改造實(shí)例3中獲得的改造抗體acd3-sh和其原型抗體okt3來刺激人pbmc中nkt細(xì)胞(cd3+cd56+)的增殖，通過對細(xì)胞計(jì)數(shù)來比較活力。材料人靜脈血，基礎(chǔ)培養(yǎng)基gt-t551(takara，wk551t)，擴(kuò)增培養(yǎng)基(gt-t551，il-21000iu/ml)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶t75(corning，430720)/t175(corning，431080)，ifn-γ(上海凱茂，注射用重組人干擾素γ伽瑪)。細(xì)胞培養(yǎng)和檢測方法利用白細(xì)胞分離液分離人pbmc細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至2e6/ml，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)。在37℃、5％co2培養(yǎng)2小時，以使單核細(xì)胞貼壁。收集懸浮細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1e6/ml。加入重組人ifn-γ(1000iu/ml)。在37℃、5％co2培養(yǎng)24小時。加入抗人cd3抗體(30ng/ml)和il-2(1000iu/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。按照1:1體積比例添加擴(kuò)增培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。之后每隔48小時取樣計(jì)數(shù)，用擴(kuò)增培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至，繼續(xù)培養(yǎng)。廣西無血清細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)DMEM培養(yǎng)基適用于各類細(xì)胞的初級培養(yǎng)。

    其他方法在一些實(shí)施方式中，還可以通過其他序列缺失、糖基化修飾和化學(xué)修飾等手段達(dá)到降低抗體與fc受體的親和力的目的。在一個推薦實(shí)施方式中，對抗體表達(dá)序列進(jìn)行改造，表達(dá)和純化抗體的fab片段。在一個推薦實(shí)施方式中，對抗體表達(dá)序列中的n297進(jìn)行突變，可以獲得重鏈無糖基化修飾的抗體(non-glycosylatedheavych**n，nghc)。在一個推薦實(shí)施方式中，用糖苷內(nèi)切酶(endoglycosidase)對抗體進(jìn)行處理，可以獲得糖基缺失或是糖基重排的抗體。在一個推薦實(shí)施方式中，用化學(xué)偶聯(lián)(conjugation)對抗體進(jìn)行處理，可以獲得側(cè)鏈修飾或偶聯(lián)了形成空間位阻基團(tuán)的抗體。可以理解，本發(fā)明所涉及的改造抗體方法不限于上述序列替換、點(diǎn)突變、序列插入、序列缺失、糖基化修飾和化學(xué)修飾這幾種，只要是經(jīng)過蛋白質(zhì)改造降低了與fc受體的親和力且不影響與目標(biāo)分子的結(jié)合力的方法均可?？贵w改造范圍在一些實(shí)施方式中，上述細(xì)胞培養(yǎng)用抗體為抗cd3抗體、抗cd16抗體、抗cd28抗體、抗cd52抗體或抗cd137抗體。例如，鼠抗人cd3的抗體ucht1、鼠抗人cd16的抗體3g8、鼠抗人cd28的抗體cd-28、鼠抗人cd52的人源化campath-1h單抗和抗人cd137的小鼠單抗4c1a9等。在一些實(shí)施方式中。

    例如將igg1亞型的抗人cd3的小鼠單抗ucht1、抗人cd16的小鼠單抗3g8和mem-154、抗人cd28的小鼠單抗cd-28、抗人cd137的小鼠單抗4c1a9等抗體的鉸鏈區(qū)和fc段替換為鼠igg4相應(yīng)的序列。在一個更加推薦的實(shí)施方式中，將這些序列替換為人igg4相應(yīng)的序列。推薦地，在進(jìn)行鉸鏈區(qū)和fc段的替換時，選擇igg1-ch1-hinge區(qū)域中盡可能靠近c(diǎn)端的一段與igg4-ch1-hinge中的相同的序列開始替換，以盡可能保持ch1和vh1的相互作用，維護(hù)fab段的功能。點(diǎn)突變在一些實(shí)施方式中，上述點(diǎn)突變是將細(xì)胞培養(yǎng)用抗體的鉸鏈區(qū)和fc段關(guān)鍵結(jié)合部位的一個或多個位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行突變。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)用抗體為igg1亞型，上述點(diǎn)突變是將細(xì)胞培養(yǎng)用抗體的第228位、第233位、第234位、第235位、第236位、第239位、第250位、第252位、第254位、第256位、第257位、第311位、第318位、第320位、第322位、第326位、第327位、第329位、第330位、第331位、第332位、第333位、第428位、第433位和第434位氨基酸中的一個或多個位點(diǎn)進(jìn)行突變。在一些實(shí)施方式中，也可對上述位點(diǎn)的臨近氨基酸進(jìn)行突變。這些位點(diǎn)中，higg1的l234和l235的主鏈和側(cè)鏈基團(tuán)都參與了與hfcγriii的結(jié)合。1640培養(yǎng)基有助于細(xì)胞的快速恢復(fù)生長。

    然后是肝部，在一些推薦實(shí)施方式中，上述免*細(xì)胞產(chǎn)品用于肺*和肝*的***。nk細(xì)胞表面富表達(dá)fcγriii(cd16)，是adcc作用的主要效應(yīng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，nk細(xì)胞可與***用抗體聯(lián)合用于adcc殺傷研究。在一些推薦實(shí)施方式中，nk細(xì)胞產(chǎn)品可與***用抗體利妥昔單抗ritu***mab聯(lián)合用于淋巴*的***。在一些推薦實(shí)施方式中，nk細(xì)胞產(chǎn)品可與***用抗體曲妥珠單抗trastuzumab聯(lián)合用于乳腺*和胃*的***。在一些推薦實(shí)施方式中，nk細(xì)胞產(chǎn)品可與***用抗體西妥昔單抗cetu***mab聯(lián)合用于頭頸部*和結(jié)直腸*的***。nk細(xì)胞還可以通過非自我或是自失效應(yīng)(missing-self)來識別和殺傷目標(biāo)。這種細(xì)胞殺傷是非mhc限制性的(non-mhc-restrictedcytoto***city)，不會引起移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease,gvhd)，因此，nk細(xì)胞可應(yīng)用于異體移植***。在一些更加推薦的實(shí)施方式中，上述高純度的nk細(xì)胞產(chǎn)品和car-nk細(xì)胞產(chǎn)品用于人同源異體細(xì)胞***，但可以理解，用于同源異體細(xì)胞***的細(xì)胞產(chǎn)品不限于此。以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。使用減血清培養(yǎng)基能減少實(shí)驗(yàn)的誤差和干擾。北京減血清細(xì)胞培養(yǎng)基供應(yīng)商家

DMEM高糖培養(yǎng)基提供了豐富的生長因子。天津MEM細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口

    自然降解、被細(xì)胞釋放的蛋白酶降解、聚合沉淀等過程)、抗體與目標(biāo)受體結(jié)合后內(nèi)吞(receptor-mediatedendocytosis)等因素相關(guān)外，還與培養(yǎng)體系中的某些細(xì)胞表面表達(dá)的fc受體能夠結(jié)合并***這些抗體(fcrdependentendocytosis)有直接關(guān)系。培養(yǎng)用的抗體通常是來源于小鼠雜交*篩選獲得的igg1亞型，例如鼠抗人cd3的抗體ucht1、鼠抗人cd16的抗體3g8、鼠抗人cd28的抗體cd-28。另外，出于提高產(chǎn)量和擴(kuò)大產(chǎn)品應(yīng)用方面的考慮，鼠源抗體進(jìn)行人源化時通常也會選擇igg1亞型，例如來源于大鼠抗人cd52的人源化campath-1h單抗。這些igg1抗體的有效濃度在培養(yǎng)體系中快速下降的問題會更加嚴(yán)重。甚至，抗體在與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合后，還會激發(fā)某些表達(dá)fc受體的效應(yīng)細(xì)胞的攻擊。這包括由表達(dá)fcγrii的巨噬細(xì)胞來進(jìn)行的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(antibodydependentcellularphagocytosis，adcp)和由表達(dá)fcγriii的nk細(xì)胞來進(jìn)行的抗體依賴的細(xì)胞殺傷(antibodydependentcellularcytoto***city，adcc)。當(dāng)培養(yǎng)體系中存在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、nk細(xì)胞等免*細(xì)胞時，這類特異性的adcp/adcc作用會快速降低目標(biāo)細(xì)胞的活率和純度。特別是，如果培養(yǎng)的目標(biāo)細(xì)胞就是巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、nk細(xì)胞等免*細(xì)胞時。天津MEM細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口