酵母重組表達(dá)的N-糖苷酶F（PNGaseF）在實(shí)際應(yīng)用中具有以下優(yōu)勢(shì)：1.**高比活性**：具有高達(dá)750,000U/mL的比活性，這表明該酶在催化反應(yīng)中具有很高的效率。2.**快速反應(yīng)**：新型的FastPNGaseF能在數(shù)分鐘內(nèi)完成徹底且無(wú)偏好性的去糖基化，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。3.適用性：PNGaseF可以用于天然或變性條件下的糖蛋白或糖多肽的去N-糖基化修飾。4.**無(wú)其他糖苷酶活性**：該酶專(zhuān)一性高，無(wú)其他糖苷酶活性，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.**His標(biāo)簽**：帶有His標(biāo)簽，便于通過(guò)親和層析進(jìn)行純化和檢測(cè)。6.**穩(wěn)定性和儲(chǔ)存條件**：在含有50%甘油的儲(chǔ)存緩沖液中，-15~-25℃保存，有效期長(zhǎng)達(dá)1年。7.**簡(jiǎn)化的實(shí)驗(yàn)流程**：FastPNGaseF簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)保持了靈敏度和重復(fù)性。8.**兼容性好**：去糖基化后的產(chǎn)物可以直接用于下游的色譜或質(zhì)譜分析，無(wú)需額外的純化步驟。9.**無(wú)偏好性**：能夠迅速且無(wú)偏好性地去除所有的N-糖鏈，確保了獲得的糖鏈分布能夠表示抗體的正確組成。SpCas9-NLS的應(yīng)用范圍廣泛，可用于細(xì)胞內(nèi)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯。Recombinant Human BD-3

pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶是一種經(jīng)過(guò)改造的高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶，與ProteinA融合，形成一種新型融合酶，應(yīng)用于CUT&Tag技術(shù)中，用于研究蛋白質(zhì)與基因組DNA的相互作用。這種融合酶具備以下特點(diǎn)：1.**高活性**：pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶是超高活性的突變形式，體外轉(zhuǎn)座效率比野生型高1000倍。2.**ProteinA融合**：pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶的N端結(jié)構(gòu)域?yàn)镻roteinA的一部分，可以與免疫球蛋白的Fc區(qū)相互作用，特別是與大多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG結(jié)合。3.**Tn5轉(zhuǎn)座酶活性**：C端結(jié)構(gòu)域?yàn)門(mén)n5轉(zhuǎn)座酶，能夠特異性識(shí)別轉(zhuǎn)座子兩端反向重復(fù)的ME序列(MosaicEnd)，并在形成轉(zhuǎn)座復(fù)合體后隨機(jī)插入靶DNA中。4.**應(yīng)用廣**：適用于CUT&Tag技術(shù)、高通量測(cè)序建庫(kù)、ATAC-seq等，特別適用于早期胚胎發(fā)育、干細(xì)胞、以及表觀遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域。5.**操作簡(jiǎn)便**：pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶的使用簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，可以在一步反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)DNA片段化和接頭連接，從細(xì)胞到二代測(cè)序文庫(kù)的轉(zhuǎn)化過(guò)程需9小時(shí)。6.**低細(xì)胞投入量**：CUT&Tag技術(shù)允許從低至60個(gè)細(xì)胞的樣本中獲得結(jié)果，甚至可以應(yīng)用于單細(xì)胞水平的研究。7.**高質(zhì)量結(jié)果**：pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶的使用可以保證DNA片段化，同時(shí)獲得的蛋白純度高、核酸殘留低。無(wú)縫克隆試劑盒（In-Fusion Cloning Kit）來(lái)源于 Thermococcus kodakaraensis，具有高熱穩(wěn)定性和校正能力，適用于長(zhǎng)片段PCR和熱啟動(dòng)PCR。

PNGaseF（肽-N-糖苷酶F，Peptide-N-glycosidaseF），也稱為N-糖酰胺酶F，是一種用于糖蛋白研究的酶，它可以從糖蛋白的N-連接糖鏈上去除糖基。以下是PNGaseF的一些關(guān)鍵特性和應(yīng)用：1.**作用機(jī)制**：PNGaseF能夠特異性地切割位于天冬酰胺殘基上的N-連接糖鏈，釋放出未被糖基化的多肽部分和糖鏈。2.**應(yīng)用領(lǐng)域**：PNGaseF在糖生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中非常重要，用于分析糖蛋白的糖基化模式和結(jié)構(gòu)。3.**酶的來(lái)源**：PNGaseF開(kāi)始是從大腸桿菌（Escherichiacoli）中分離出來(lái)的，現(xiàn)在也可以通過(guò)重組DNA技術(shù)在其他宿主細(xì)胞中表達(dá)。4.**酶的純度和活性**：商業(yè)化的PNGaseF通常具有高純度和高比活性，確保了在實(shí)驗(yàn)中的高效性和可重復(fù)性。5.**使用條件**：PNGaseF在溫和的條件下工作，通常在pH7.5至9.0之間，溫度在37°C左右。6.**穩(wěn)定性**：PNGaseF在儲(chǔ)存時(shí)通常需要冷凍保存，以保持其活性。在適當(dāng)?shù)臈l件下，該酶可以保持穩(wěn)定和活躍。7.**樣品準(zhǔn)備**：在使用PNGaseF之前，糖蛋白樣品需要適當(dāng)準(zhǔn)備，可能包括純化和緩沖液交換，以確保反應(yīng)條件的一致性。

EndoS糖苷內(nèi)切酶S（Endo-S）的特異性主要體現(xiàn)在其對(duì)糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的識(shí)別和切割能力上。以下是Endo-S的一些關(guān)鍵特異性特點(diǎn)：1.**糖鏈識(shí)別**：Endo-S能夠特異性識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)中的某些特定序列或結(jié)構(gòu)，尤其是N-連接糖鏈的殼二糖重要結(jié)構(gòu)。2.**切割位點(diǎn)**：Endo-S在糖鏈的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，通常是在N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和天冬酰胺之間的β-N-糖苷鍵。3.**不影響抗原性**：Endo-S的切割位點(diǎn)選擇性高，不會(huì)破壞糖蛋白的抗原決定簇，因此在某些應(yīng)用中可以保持糖蛋白的免疫原性。4.**應(yīng)用多樣性**：Endo-S可以用于多種糖蛋白的去糖基化，包括抗體和其他具有N-連接糖鏈的蛋白質(zhì)。5.**研究和藥物開(kāi)發(fā)**：在研究糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能時(shí)，Endo-S提供了一種工具來(lái)研究糖鏈對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響。此外，在藥物開(kāi)發(fā)中，Endo-S用于制備糖鏈定點(diǎn)ADC化合物，通過(guò)精確控制藥物與抗體的連接點(diǎn)，提高藥物的療效和減少副作用。6.**兼容性**：Endo-S對(duì)多樣化的LacNAc修飾顯示出良好的兼容性，可以接受不同生物正交基團(tuán)、熒光基團(tuán)等衍生物作為底物，實(shí)現(xiàn)抗體糖基化修飾。7.**高效性**：Endo-S在催化糖鏈轉(zhuǎn)移或切割反應(yīng)中表現(xiàn)出高效性，有助于實(shí)現(xiàn)高效獲得功能修飾的糖工程抗體。牛痘DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I具有特異性識(shí)別能力，能夠識(shí)別雙鏈DNA中的5'-(C/T)CCTT-3'序列。

EndoS酶在抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）研究中的具體應(yīng)用主要體現(xiàn)在糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)方面。根據(jù)上海藥物研究所的研究進(jìn)展，EndoS酶被用于實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)ADC化合物的“一步”制備，這是一種新穎的糖鏈定點(diǎn)ADC制備策略。該策略利用了新穎截短型糖結(jié)構(gòu)的藥物-連接子和野生型糖苷內(nèi)切酶EndoS2，將小分子細(xì)胞毒藥物直接定點(diǎn)連接到抗體糖基化位點(diǎn)，從而克服了傳統(tǒng)糖鏈定點(diǎn)ADC制備策略的限制。具體來(lái)說(shuō)，研究人員通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，EndoS2酶可以將二糖底物L(fēng)acNAc轉(zhuǎn)移至去糖抗體N297位糖基化位點(diǎn)，并且LacNAc半乳糖6號(hào)位唾液酸化修飾不影響EndoS2的轉(zhuǎn)糖基化活性。這一發(fā)現(xiàn)使得EndoS2和LacNAc的組合可以直接實(shí)現(xiàn)野生型抗體的糖基化改造，且EndoS2對(duì)多樣化LacNAc修飾的兼容性，可以高效獲得多樣性功能修飾的巖藻糖化或去巖藻糖化的糖工程抗體。此外，研究人員還利用疊氮化修飾的LacNAc底物實(shí)現(xiàn)了抗體糖基化位點(diǎn)的“一步”疊氮化修飾，并通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)藥物-連接子，實(shí)現(xiàn)了“兩步”制備得到定點(diǎn)ADC化合物。

將MAGE-A3基因序列克隆到一個(gè)表達(dá)載體中，該載體通常包含有抗生物質(zhì)抗性基因、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)。Recombinant Human BD-3

EndoS糖苷內(nèi)切酶在ADCs制備中的具體應(yīng)用步驟，根據(jù)上海藥物研究所的研究，可以概括為以下幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：1.**篩選糖底物和糖苷內(nèi)切酶**：研究人員篩選了一系列糖底物和糖苷內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)Endo-S2酶能夠?qū)⒍堑孜風(fēng)acNAc轉(zhuǎn)移至去糖抗體N297位糖基化位點(diǎn)，且LacNAc半乳糖6號(hào)位唾液酸化修飾不影響Endo-S2的轉(zhuǎn)糖基化活性。2.**抗體糖基化改造**：利用Endo-S2和LacNAc的組合，直接實(shí)現(xiàn)野生型抗體的糖基化改造。Endo-S2對(duì)多樣化LacNAc修飾的兼容性，可以高效獲得功能修飾的糖工程抗體。3.**設(shè)計(jì)合成藥物-連接子復(fù)合物**：研究人員設(shè)計(jì)并合成了LacNAc-linker-drug復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)ADC化合物“一步”組裝的關(guān)鍵。4.**“一步”定點(diǎn)偶聯(lián)**：通過(guò)Endo-S2的催化作用，將小分子細(xì)胞毒藥物通過(guò)特定的糖鏈結(jié)構(gòu)直接定點(diǎn)連接到抗體的糖基化位點(diǎn)，簡(jiǎn)化了ADCs的制備流程。5.**評(píng)價(jià)和測(cè)試**：對(duì)獲得的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)均一性、親水性、體外穩(wěn)定性及體外活性的測(cè)試。測(cè)試結(jié)果顯示，這些化合物具有非常好的結(jié)構(gòu)均一性（DAR=2）、親水性和體外穩(wěn)定性，并且在體外具有強(qiáng)大的瘤抑制活性。