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雙抗性TOPO載體的設(shè)計缺點遠大于優(yōu)點
雙抗性TOPO載體的設(shè)計缺點遠大于優(yōu)點
Amp氨芐/Kana卡那雙抗性TOPO載體的歷史
20年前，市場上d一代商品化topo載體是invitrogen購買了zhuan利license開發(fā)的，其中*****的topo載體pCR 2.1-TOPO，這是雙抗性的topo載體。在中國TA克隆市場占有率極高的是Promega的pGEM T載體和Takara的pMD 18 T載體，這些載體采用傳統(tǒng)T4連接酶連接，全部是Amp單抗性。從理論上說， Topo異構(gòu)酶原理的TOPO載體并沒有要求在技術(shù)上必須做成雙抗性的才能使用。完全可以做單抗性的TOPO載體。市場上目前絕大部分的載體都是單抗性的， 就已經(jīng)說明，雙抗性只是在一個很狹窄的范圍內(nèi)有少量需求，甚至很多同學(xué)在做克隆連接的時候就沒有碰到過要雙抗性的情況
1.為什么invitrogen當時設(shè)計Amp氨芐/Kana卡那雙抗性TOPO載體？
做為普通的PCR產(chǎn)物克隆載體，是完全用不到雙抗性的，既往幾乎所有廠家的T載體/平末端克隆載體，都是單抗性的（雙抗性完全沒有技術(shù)門檻，只要在質(zhì)粒里面添加一個卡那抗性基因就可以）。但是為什么invitrogen特立獨行設(shè)計雙抗性TOPO載體呢？ 推測原因可能是invitrogen的載體系統(tǒng)很多，其中***的gateway系統(tǒng)里面有很多載體是Amp抗性和kana抗性的?？赡転榱朔奖阍谶@個系統(tǒng)中通用，所以設(shè)計了雙抗性。只是適合自身情況才設(shè)計的。
下圖為invitrogen的雙抗性設(shè)計的載體
2. Amp氨芐/Kana卡那雙抗性TOPO載體的缺點
雙抗性設(shè)計，增加插入了卡納抗性序列，載體大小至少增加了1kb左右，造成兩個缺點：
（1）載體可連接片段更短
TOPO載體和傳統(tǒng)TA克隆載體不同，載體與可容納的插入片段是成反比的。雙抗性TOPO載體比單抗性TOPO載體大了一倍多，大的載體能容納連接的片段比小的載體短一些。也就是說單抗性載體能連接更長的片段。
（2）轉(zhuǎn)化子數(shù)量效率更低
連接完的質(zhì)粒，要轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，質(zhì)粒大小和轉(zhuǎn)化效率成反比，而且是指數(shù)級的反比，也就是越小的片段越容易轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化效率**高于大質(zhì)粒。
3.卡那Kana抗性的優(yōu)點和缺點
（1）優(yōu)點：卡納抗性一般不會長衛(wèi)星菌落
Amp抗性生長久了， 容易長衛(wèi)星菌落， 但是只要控制時間， 及時把生長好的板子放進4度冰箱保存，就可以避免這個問題
（2）缺點：復(fù)蘇時間比Amp抗性復(fù)蘇要長1個小時
轉(zhuǎn)化后，卡那Kana抗性至少需要復(fù)蘇1個小時，Amp抗性**快可以不復(fù)蘇（不用做加LB培養(yǎng)液的復(fù)蘇步驟）
4.Aidlab：新一代TOPO載體技術(shù)的**者和leader
1.采用了Amp氨芐單抗性設(shè)計
去掉Kana卡那抗性序列，縮短了1kb，全長基本就是復(fù)制子+Amp抗性，綜合起來全長*1.85kb。是目前國內(nèi)**小的TOPO載體。
2.Aidlab的TOPO載體能連接的片段更長，同等條件下，連接效率轉(zhuǎn)化子數(shù)量是一般公司的10-100倍
3.復(fù)蘇時間可以短到0分鐘
11年前Aidlab的 TOPO克隆載體技術(shù)早已處于**水平，Aidlab的新一代單抗性TOPO載體任何一個指標都遠超對手！
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