《PNAS》解讀：分子互作機(jī)制

來源：發(fā)布時(shí)間：2024-10-21

第一步，確定與下游蛋白分子的互作關(guān)系

進(jìn)行內(nèi)源Co-IP實(shí)驗(yàn)和GST pulldown實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)USP8與GPX4互作（圖1a-c）。

第二步，USP8與GPX4蛋白結(jié)合的具**置

為了探索USP8與GPX4蛋白結(jié)合的位置，針對(duì)USP8構(gòu)建不同的突變體分別進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)USP8通過 aa1-313、aa715-1118區(qū)域與GPX4結(jié)合（圖1d-e）。

第三步，USP8如何影響GPX4蛋白的穩(wěn)定性

USP8是一個(gè)去泛素化酶。Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，USP8能降低GPX4的泛素化水平，而酶非活性突變體USP8-c786a則不能去除GPX4的泛素鏈，表明USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（圖1f）。

圖1 USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（Ref. Fig 4/S4）

第四步，確定USP8去除GPX4的Ub K48鏈泛素化

泛素分子可以通過其七個(gè)賴氨酸(K)殘基中的一個(gè)(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)連接形成不同的泛素鏈?；诖耍珻o-IP分析發(fā)現(xiàn)GPX4被K27和K48連接的泛素化修飾（圖2a）。另外，Co-IP分析顯示USP8過表達(dá)降低GPX4上K48連接的泛素化，而不影響K27連接的泛素化（圖2b），表明USP8主要去除GPX4上K48連接的泛素化。體外去泛素化試驗(yàn)表明（注：Ub(K48O)(只有完整的Lys48殘基的Ub)），USP8過表達(dá)以去泛素酶活性依賴性方式去除GPX4上K48連接的泛素化（圖2c）。

第五步，確定USP8去除GPX4蛋白泛素化位點(diǎn)

之前的研究已報(bào)道K48、K125、K127、K135和K151是GPX4的潛在泛素化位點(diǎn)。構(gòu)建不同的泛素化位點(diǎn)突變體進(jìn)行Co-IP分析，發(fā)現(xiàn)GPX4 K48R、K125R、K127R和K151R突變體K48連接的泛素化減少（圖2d）。另外，USP8過表達(dá)降低GPX4 WT、K125R、K127R和K151R突變體的泛素化，但未能消除GPX4 K48R突變體的泛素化（圖2e）。表明USP8主要去除GPX4上K48殘基的泛素化。表明USP8作為穩(wěn)定GPX4的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子，主要通過去除GPX4上K48連接的泛素化來防止其蛋白酶體介導(dǎo)的降解。